細胞核的功能精選(九篇)

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第1篇：細胞核的功能范文

[關鍵詞] 組蛋白去乙?；?吸煙;慢性阻塞性肺病

[中圖分類號] R563[文獻標識碼]A [文章編號]1673-7210(2009)07(c)-016-04

Relationship between HDAC activity and lung function as well as smoking in peripheral blood mononuclear cells of COPD patients

CHEN Yanwei1, YANG Jiong2

(1.Department of Pulmonary Medicine, Shenzhen Nanshan Hospital of Guangdong Medical College, Shenzhen518052, China; 2.Department of Pulmonary Medicine, People's Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China)

[Abstract] Objective: To investigate the histone deacetylase (HDAC) activity in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of COPD patients, and determine the relationship between HDAC activity in PBMC and lung function as well assmoking quantity in COPD patients. Methods: COPD patients, healthy smokers and healthy nonsmokers were selected in our study. The peripheral blood of all subjects were obtained, and PBMC was separated via density gradient centrifugation. Histone was extracted and HDAC activity was detected. The lung function, smoking information of all subjects were recorded. Results: HDAC activity in PBMC from COPD patients was decreased by 40% compared with normal nonsmokers [(12.86±6.14) μmol/(L?μg) and (21.39±4.92) μmol/(L?μg), P=0.000)], this decrease showed statistical significance in stage 1, 2 and 3. HDAC activity in PBMC from healthy smoker was 40% lower than healthy nonsmokers [(12.50±4.27) μmol/(L?μg) and (21.39±4.92) μmol/(L?μg), P=0.000]. HDAC activity in PBMC from COPD was negatively correlated with smoking quantity (r=-0.867, P=0.000 for COPD patients; r=-0.607, P=0.000 for all subjects). In COPD patients who smoked more than 35 pack years and smoked less than 35 pack years, the HDAC activity in PBMC of the former decreased more than a half than that of the later. Conclusion: Smoking is one of the important reasons causing the decrease of HDAC activity in PBMC of COPD patients. HDAC activity in PBMC of COPD patients shows zero correlation with lung function (FEV1, FEV1%, FVC, FVC% and FEV1/FVC), suggesting smoking may have different mechanisms on the local and whole damage of lung.

[Key words] Histone deacetylase; Smoking; Chronic obstructive pulmonary disease

肺部炎癥是引起慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)氣流受限(肺功能)的主要原因。有研究表明,肺部炎癥的標志物(IL-8、IL-6、CRP等)與氣流受限(肺功能)程度呈正相關。COPD患者肺組織和肺泡巨噬細胞中的HDAC活性與氣流受限呈正相關,HDAC活性越低,氣道炎癥越重,FEV1%越低[1]。HDAC活性降低源于吸煙引起的氧化應激的損傷。吸煙可引起直接肺氧化應激損傷,也可引起間接的系統性氧化應激。

肺泡巨噬細胞由外周血單核細胞遷移至肺分化而來。因此,本研究假設外周血單核細胞中HDAC活性低于健康對照,并觀察外周血單核細胞中HDAC活性與COPD患者氣流受限(肺功能)的關系,同時觀察吸煙量與HDAC活性的關系,以觀察HDAC活性是否受吸煙量的影響。

1 對象與方法

1.1 受試者基本情況

收集在武漢大學人民醫院體檢及就診的穩定期COPD患者。正常對照為健康志愿者。經患者知情同意,抽取外周靜脈血20 ml,加少量肝素抗凝,在4 h內進行外周血細胞分離。

1.2 穩定期COPD診斷及分級標準

參照GOLD(2006修訂版)和中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組制訂的慢性阻塞性肺病診治指南(2002)。所有患者均除外心、腦血管、肝、腎疾病、糖尿病、腫瘤、風濕、結締組織疾病,以及肺結核、支氣管擴張、支氣管哮喘及肺纖維化患者。

1.3 肺功能測定

所有受試者均行肺功能測定,采用Vmax6200(American Sensormedics, Vmax 229 series,Yorba Linda,California)肺功能系統檢測FVC、FVC%、FEV1、FEV1%、FEV1/FVC,由同一熟練技師操作,以保證測試的一致性。每位被測試者肺功能測定前3 d內未使用支氣管擴張劑,2周內未使用茶堿和激素。

測試方法:吸入200 μg葛蘭素后10 min,平靜正常呼吸,遂后充分吸氣至肺總量位,迅速用最大力呼氣,呼氣時間≥6 s,或時間-容量曲線顯示呼氣相平臺出現且超過2 s后,用最快速度用力吸氣至肺總量位。每個被測試者分別至少測定3次(一般最多不超過8次),每個被測試者最佳值與次佳值2次差異小于5% FVC或0.5 L)。

1.4 人外周血單核細胞分離

人外周血單核細胞分離用密度梯度離心法[2]。將靜脈血與Hank's buffered salt solution (HBSS)1×緩沖液1∶1混合后共40 ml,裝于50 ml試管中。將混合血與人淋巴細胞分離液(Lymphoprep,Norway,1.077 g/ml)以2∶1體積混合。配平后用TDL-40L高速水平離心機離心,2 000 r/min(1 100 g/min),30 min。吸取中間白色薄霧層于新管。加HBSS于每管,將吸取液與HBSS混勻,HBSS體積大于1倍吸取液體積。配平后1 100 r/min,離心8 min。棄上清,加入HBSS吹打,移入一新試管中離心1 000 r/min,8 min,棄上清。將剩余液體混勻,吸取少量于細胞計數板計數,并用臺盼藍染色鑒定細胞活性。如果細胞總數大于1×107個/ml,活性大于95%,視為合格標本;用1 ml槍頭吸取剩余液體于標記Ep管中,-70℃凍存。 1.5 直接組蛋白提取

組蛋白提取用HCl和H2SO4 4℃過夜法[3]。裂解液[10 mmol/L Tris-HCl,pH 6.5,50 mmol/L亞硫酸氫鈉,1% Triton X-100, 10 mmol/L MgCl2,8.6%蔗糖,完全蛋白酶抑制劑混合物(羅氏分子生化公司),20 min,4℃];核沖洗緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,13 mmol/L EDTA,pH 7.4)。

將細胞微離心5 min;用冰凍裂解緩沖液反復沖洗片狀沉淀物,直至浮于表面的物質清除(每次離心7 500 g/min,5 min)。用核沖洗緩沖液沖洗核片狀沉淀物,并且用50 μl 0.2 mol/L HCl和0.2 mol/L H2SO4在蒸餾水中懸浮。4℃過夜提取細胞核,微離心剩余物質10 min,用1 ml冰凍丙酮混合上清液,-20℃過夜。微離心樣本10 min,用丙酮沖洗,干燥,并用蒸餾水稀釋。含有組蛋白的上清液樣品用Bradford protein kit(Bio-Rad)定量。Bradford法(考馬斯亮藍)測組蛋白濃度。

1.6 HDAC活性檢測

細胞核提取物HDAC活性檢測使用HDAC活性熒光分析試劑盒(Cayman,USA),嚴格按照試劑盒說明操作。

1.7 統計學處理

結果用SPSS 11.0統計學軟件進行分析。數據以均數±標準差(x±s)表示,多組間比較采用方差分析;相關性采用Spearman相關性分析;P

2 結果

2.1 一般資料

COPD患者26例,均為吸煙者,其中,1期7例,2期8例,3期8例,4期3例;健康吸煙者10例;健康非吸煙者13例,所有受試者均為男性,其身高、體重等無顯著性差異(P>0.05)。COPD組與健康吸煙組吸煙量無顯著性差異(P>0.05)。COPD組平均年齡高于健康吸煙組和健康非吸煙組(P0.05)。

2.2 COPD患者外周血單核細胞中的HDAC活性

COPD患者外周血單核細胞總HDAC活性較健康非吸煙者低40%左右[(12.86±6.14) μmol/(L?μg)和(21.39±4.92) μmol/(L?μg),P=0.000];在1、2、3期達到顯著性差異(圖1);其活性與健康吸煙者比較,無顯著性差異[(12.86±6.14) μmol/(L?μg)和(12.50±4.27) μmol/(L?μg),P=0.864]。健康吸煙者外周血單核細胞中的HDAC活性較健康非吸煙者低40%,與COPD患者比較,無顯著性差異(P>0.05)。

圖1外周血單核細胞中的HDAC活性比較

Fig. 1Comparison of HDAC activity of PBMC among subgroups

2.3 COPD患者外周血單核細胞中的HDAC活性與肺通氣功能的關系

COPD患者外周血單核細胞中HDAC活性與肺通氣功能均無統計學相關(表1)。

表1 外周血單核細胞中HDAC活性與FVC、FEV1、FEV1/FVC的關系

Tab.1 Relationship between FVC, FEV1, FEV1/FVC

and HDAC activity of PBMC

2.4 吸煙受試者外周血單核細胞中HDAC活性與吸煙量的關系

外周血單核細胞中的HDAC活性與吸煙量(包年)呈負相關(在COPD患者中,r=-0.867,P=0.000;在所有吸煙者中,r=-0.607,P=0.000)(圖2)。

圖2外周血單核細胞中HDAC活性與吸煙的關系

(A:COPD患者;B:所有吸煙者)

Fig. 2Relationship between HDAC activity in PBMC and

smoking quantity

(A: COPD patients; B: all subjects enrolled)

吸煙量超過35包年的COPD患者外周血單核細胞中的HDAC活性平均值明顯低于吸煙量低于35包年者(圖3)。

圖3吸煙量對COPD患者外周血單核細胞

中HDAC活性平均值的影響

Fig. 3Effect of smoking quantity on mean HDAC

activity of PBMC in COPD

3 討論

研究結果顯示,COPD患者外周血單核細胞中的HDAC活性低于健康非吸煙者,與健康吸煙者比較,無顯著性差異;COPD患者外周血單核細胞中HDAC活性的降低與COPD氣流受限(肺功能)無明顯相關,與患者吸煙量呈負相關,提示外周血單核細胞中的HDAC活性降低可能是吸煙的直接作用。

穩定期COPD患者外周血單核細胞中的HDAC活性降低與相同吸煙量的非COPD吸煙者的下降相同,而且兩組研究對象隨吸煙量增加,HDAC的下降更為明顯,提示人外周血單核細胞中HDAC下降與吸煙密切相關。

吸煙也可以引起染色體重構[4],影響NF-κB的表達,促使炎癥基因表達[5]。吸煙時每噴煙霧中至少含有10種氧化分子[6],這些氧化分子可以產生氧化應激(oxidative stress)。吸煙引起的氧化應激使細胞核HDAC活性降低,同時可以明顯降低上皮細胞的HDAC2表達[7-8],使炎癥因子表達增加;這種氧激發可以被抗氧化物N-乙酰半胱氨酸所阻斷[9]。健康吸煙者肺泡巨噬細胞HDAC活性低于健康不吸煙者[10]。氧化應激可以通過影響細胞核HDAC活性而影響炎癥基因的表達。體外研究顯示,氧化應激可以明顯降低HDAC活性和上皮細胞HDAC2的表達[7]。

本研究通過提純單核細胞核HDAC并測定其活性,提示外周血單核細胞中的HDAC活性與吸煙量呈負相關。因此,COPD患者外周血單核細胞HDAC活性降低可能系吸煙所致。

本研究顯示,COPD患者外周血單核細胞中的HDAC活性降低與COPD氣流受限(肺功能)零相關。

肺功能是目前COPD分級的主要依據,主要反映氣道的阻塞程度,并不能反映COPD的炎癥程度。Ito等[1]發現HDAC活性在COPD患者的支氣管組織和肺泡巨噬細胞中降低,這種降低與COPD氣流受限(FEV1、FEV1/FVC)呈正相關。而本研究并未發現外周血單核細胞中的HDAC活性降低與COPD氣流受限(肺功能)相關,其原因可能與吸煙對肺部和全身的損害不同有關。

吸煙的煙霧中含有眾多物質,可以引起直接和間接肺損害。有害成分可以直接影響HDAC的活性或破壞肺組織,引起肺組織的急性損害。只有部分物質可以進入血液(如氧自由基等)并長期在血液中停留。這些物質可以作用于單核細胞,通過抑制HDAC活性來促進炎癥介質的產生。即使停止吸煙,炎癥基因的表達維持了這種慢性炎癥。炎癥基因的表達受促炎癥轉錄因子的調節,這些轉錄因子主導、放大并且維持了COPD的慢性炎癥反應。肺部的局部急性炎癥與肺功能(氣流受限)呈正相關。而本研究顯示,在穩定期COPD患者的外周血單核細胞中,HDAC活性與COPD肺功能(氣流受限)無關,提示吸煙對肺部的直接損害與全身的間接損害可能源于不同的機制。

[參考文獻]

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第2篇：細胞核的功能范文

【關鍵詞】 結核分枝桿菌; 抗原提呈; T細胞亞群; 流式細胞術; 激光共聚焦顯微鏡

［Abstract］ AIM: To explore whether the human peripheral γδ T cells stimulated by polypeptide heat resistant antigen from Mycobacterium tuberculosis (MtbHAg) express phenotype and have the fuction of antigen presentation. METHODS: The monocytes isolated by adhesion method from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured with GMCSF， IL4 and induced into the mature dendritic cells by adding LPS. PBMCs were stimulated with MtbHAg and IL2 to expand predominantally γδ T cells that were further purified by flow sorting. The pure T cells were isolated from PBMCs using adhesion revomal and nylon column method， labeled with CFSE， and cultured in alone with Mtb secretory antigen (MtbSAg)， in monocytes with MtbSAg， or with MtbSAg prepulsed dendritic cells or MtbHAg activated γδ T cells for 11 days. The proliferation of the CD4+T cells were measured by flowcytometry. The MtbHAg activated γδ T cells were incubated with FITC labelled MtbSAg for different time， and the ingestion of MtbSAg by γδ T cells was measured by flowcytometry and observed with laser confocal microscopye. RESULTS: The expressions of MHCII and costimulatory molecules CD80 and CD86 on γδ T cells that activated by MtbHAg marketly incrased in comparison with that on the resting γδ T cells. The expanded cell counts and proliferation index of the pure nave T cells that induced by MtbSAg pretreated activated γδ T cells were similar to that induced by mature DC. By using flowcytometer and laser confocal microscope， FITC labellaed MtbSAg was ingested by the activated γδ T cells. CONCLUSION: γδ T cells stimulated by polypeptide MtbHAg express the phenotype of professional antigenpresenting cells and they are able to present MtbSAg to nave T cells to induce the proliferation of CD4+T cells.

［Keywords］Mycobacterium tuberculosis; antigen presentation; T lymphocyte subpopulation; flow cytometry; laser confocal microscope

以往的研究表明機體在抗結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis， Mtb）感染免疫中， 主要有αβ T細胞（CD4＋和CD8＋T細胞）和巨噬細胞發揮重要作用， 而近年的許多研究證明， γδ T細胞在抗Mtb感染中也起到重要的防御作用， 并可能通過與其他免疫細胞之間相互作用， 影響機體在抗Mtb感染中的免疫應答過程。在健康人外周血中， γδ T細胞僅占T細胞庫的2%～10%， 根據其TCRδ鏈V區片段不同又可以分為Vδ1+和Vδ2+二種亞型， Vδ1+T細胞主要分布在黏膜上皮和皮膚組織， 而Vδ2+T細胞則主要分布在外周血中。已有研究發現Vδ2+T細胞能識別小分子的非肽類抗原， 并在此類抗原的刺激下產生顯著的擴增［1， 2］。有研究發現， 從扁桃體分離的未活化的γδ T細胞用異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate， IPP) 和來自大腸埃希菌的非肽類抗原4羥基3甲基2烯基焦磷酸［(E)4hydroxy3methylbut2enyl pyrophosphate， HMBPP］刺激后， 表達協同刺激分子和MHCⅡ類分子的能力與單核細胞來源的， 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激誘導成熟的樹突狀細胞（dendritic cell， DC）相似［3］。但以往的研究， 以及我們以前的實驗發現來自結核桿菌的多肽類耐熱抗原也可優勢擴增人Vδ2+T細胞［4， 5］。本實驗中， 我們用多肽類Mtb耐熱抗原(Heat resistant antigen， MtbHAg)優勢擴增人外周血中的γδ T（Vδ2+）細胞， 觀察活化后的γδ T細胞是否能表現出抗原提呈細胞的表型以及是否具有抗原提呈的功能， 探討γδ T細胞在抗Mtb感染的天然免疫和獲得性免疫中的橋聯作用。

1 材料和方法

1.1 材料 Mtb耐熱抗原(MtbHAg)和Mtb分泌性抗原(MtbSAg)由本實驗室從培養的MtbH37Ra株制備獲得， 羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFSE) 購自Molecular Probes公司; RPMI1640培養液(GIBCO公司) 補充L谷氨酰胺2 mmol/L、 二巰基乙醇(2ME)50 μmol/L、 丙酮酸鈉1 mmol/L、 慶大霉素50 mg/L和新生小牛血清(NBS， 杭州四季青公司) 100 mL/L后為完全RPMI1640培養液; 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate， FITC) 和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide， DMSO) 購自Merk 公司; 熒光抗體小鼠抗人CD4PE、 小鼠抗人TCRγδPE、 小鼠抗人CD14FITC、 小鼠抗人HLADRPecy 5.5和小鼠抗人CD83FITC等購自Caltag公司; 小鼠抗人CD80FITC和CD86FITC購自eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 γδ T細胞的活化和分選純化 抽取健康志愿者外周血5～10 mL， 肝素抗凝， 用淋巴細胞分離液和梯度離心法常規分離獲取外周血單個核細胞（peripheral blood monouclear cells， PBMC）， 將PBMC用RPMI1640完全培養液調整細胞密度為1×109/L， 加入24孔板， 再加入Mtb耐熱抗原(MtbHAg) 2.5 mg/L， 置于37℃、 50 mL/L CO2中培養5 d后分孔培養， 每隔3 d加入rhIL2 5×104 U/L， 約9 d即可得到富含γδ T細胞的活化T細胞， 經抗TCRPE染色后， 用PBS制備分選用細胞懸液(1×1010/L)， 在流式細胞儀FACSCalibur上進行分選獲取純化的γδ T細胞。

1.2.2 DC的體外培養及檢測 常規方法分離獲取PBMC， 加入24孔板中， 細胞密度為每孔5×109/L， 37℃、 50 mL/L

CO2培養2 h后吸去懸浮細胞， 并用預熱的RPMI1640輕洗培養孔， 以去除殘留懸浮細胞， 即獲得貼壁細胞。補充培養液后加入rhGMCSF 100 μg/L， IL4 100 μg/L， 第3天時半量換液， 并再次添加GMCSF和IL4， 第6 天半量換液的同時再加入LPS 1 mg/L， 第8天收獲懸浮細胞， 分別用小鼠抗人CD83FITC， CD14FITC和HLADRPeCy5.5標記后在流式細胞儀檢測外周血單核細胞來源DC的成熟程度。

1.2.3 尼龍毛柱法分離純化T淋巴細胞 常規方法分離獲取PBMC， 調整細胞密度為1×109/L， 加入6孔板中， 2 mL/孔， 置于37℃、 50 mL/L CO2中培養2 h后， 吸出懸浮細胞， 調整細胞密度為1×1010/L， 注入已制備好的尼龍毛柱內， 另加入5 mL的完全RPMI1640液， 密封， 37℃、 50 mL/L CO2中孵育1 h后， 用RPMI1640完全培養液沖洗毛柱， 收集沖洗出來的細胞， 即為純化T細胞（purified T， pu T)。

1.2.4 CFSE標記pu T 將獲得的pu T調整細胞密度為5×109/L， 每毫升細胞懸液加入1 μL CFSE， 使其終濃度為2 μmol/L， 37℃染色10 min后取出用含100 mL/L NBS的完全RPMI1640培養液洗2次后將染色后pu T制成細胞懸液(1×109/L)。此即為CFSE標記的pu T (pu TCFSE)。

1.2.5 FITC標記MtbSAg 將MtbSAg(1 g/L) 1 mL加入已處理過的透析袋中， 扎緊袋口放入pH9.5碳酸鹽緩沖液透析過夜， 透析后取出， 加DMSO配制FITC溶液（1 g FITC/L）混合， 使FITC/MtbSAg的比例為50 μg∶1 mg。室溫避光在水平振蕩器上慢速振搖2 h后轉入透析袋中， 對200 mL PBS透析8 h后換液， 共3次。4℃避光保存。

1.2.6 四種不同的培養方法刺激αβ T細胞擴增 CFSE標記的pu T， 調整細胞密度為1×109/L， 加入24孔板培養， 每孔1 mL， 并按以下四種不同方法加入MtbSAg或抗原提呈細胞。a: CFSE標記的pu T單獨培養， 同時加入MtbSAg 25 mg/L。b: CFSE標記的pu T中加入單核細胞 (單核細胞: pu TCFSE為1∶100)， 加MtbSAg 25 mg/L。c: 體外培養的單核細胞來源的成熟DC(MDC)與終濃度25 mg/L 的MtbSAg孵育， 37℃ 2 h后， RPMI1640洗滌3次， 加入pu TCFSE (DC∶Pu TCFSE為1∶100) 中培養。d: 流式分選純化的MtbHAg活化γδT細胞與終濃度為25 mg/L的MtbSAg孵育， 37℃ 2 h后， RPMI1640洗滌3次， 加入到pu TCFSE(活化的γδT細胞: pu TCFSE為1∶100)中培養。上述4種細胞培養在第4天時加IL2 (5萬U/L)擴增細胞， 隔天半量換液并添加同量的IL2以維持細胞生長。

1.2.7 FCM和激光共聚焦檢測活化γδ T細胞對FITC標記MtbSAg的攝入 將MtbHAg活化的γδ T細胞的密度調整為1×1010/L， 取100 μL細胞懸液， 加FITC標記的MtbSAg 10 μL， 抗TCRγδPE 3 μL， 避光 37℃， 水浴30 min 至120 min后， PBS洗滌3次， 盡量去除殘余液體， 加入10 g/L多聚甲醛200 μL 固定后用流式細胞儀檢測FITC陽性細胞數， 表示攝入MtbSAg細胞的比率。同時將水浴90 min的試管輕彈混勻后取出2 μL， 加少量甘油混合后滴在載玻片上， 加上蓋玻片后即在激光共聚顯微鏡（Nikon C1 Si）下觀察和拍攝記錄， 獲取的圖象文件用Freeviewer軟件分析顯示。

1.2.8 統計學分析 實驗數據以x±s表示， 數據處理采用SPSS13.0統計軟件。樣本均數的兩兩比較， 采用t檢驗， P＜0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血單核細胞來源DC的表型檢測 PBMC來源的單核細胞經GMCSF， IL4培養6 d后加入LPS誘導為成熟的DC后， 用FCM檢測其表型， 發現HLADR仍為高表達（81.89%)， 代表DC成熟的CD83與培養前低表達（7.83％）相比非常顯著地高表達(85.40%)， 而單核細胞的特征標志CD14從培養前的87.2%降低到5.31%。

2.2 活化的γδT細胞表達協同刺激分子 檢測健康人外周血中靜止的γδ T細胞表面CD80、 CD86和HLADR的表達水平非常低， 分別為(1.37±2.36)%， (4.13±3.33)%和(8.84±5.44)%; 而經MtbHAg活化后γδ T細胞CD80、 CD86和HLADR的表達分別增加到(62.33±7)%、 (89.12±3.5)%、 (80.56±7.29)% (圖1)。

2.3 不同培養方法對純化初始T細胞增殖總數的影響 在4種不同培養方案中， 加入的純化T細胞數均為1.0×106， 單獨加MtbSAg的a組， 和加單核細胞和MtbSAg的b組， 培養到第11天時， 細胞數分別為1.2×106和5.6×106。而純化T細胞加入預先與MtbSAg處理的DC（c組）和γδ T細胞（d組）， 培養11 d后的細胞數分別為7.79×106和8×106(圖2)。

2.4 FCM分析CD4+T細胞的增殖情況和Modfit軟件分析CD4+T細胞的增殖指數 用CFSE標記的純化T細胞用4種方法培養到第11天時， 標記CD4熒光mAb后用流式細胞儀測定和分析， 結果表明純化T細胞單獨加MtbSAg的a組， 增殖的CD4+T細胞僅占4.5%; 加單核細胞和MtbSAg的b組， 增殖的CD4+T細胞所占比例為35.4%， 而加入MtbSAg預處理的成熟DC和活化γδT細胞的c組和d組， 增殖的CD4+T細胞所占比例分別達到56.4%和57.1%（圖3A）。用Modfit軟件中的增殖分析模塊進行分析， 得到CD4+T細胞各代細胞所占百分率， 增殖指數(Proliferation Index， PI， 即增殖后細胞總數與增殖前細胞總數的比值。在加入MtbSAg預處理的DC（c組）和活化γδT細胞（d組）， 培養第11天時CD4+T細胞的PI分別為58.9和51.9， 且增殖的代數主要集中在第9、 10代， 分別為75.93%和75.71%。加入單核細胞的b組CD4+T細胞的PI為24.39， 第9、 10代所占的比例為57.65%， 而僅有純化T細胞的a組中， CD4+T細胞的PI和第9、 10代所占的比例僅為4.5%和4.04%（圖3B）。

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察活化的γδ T細胞攝入SAg MtbHAg刺激活化的γδ T細胞與FITC標記的MtbSAg在37℃孵育90 min 時， 同時加入抗TCRγδ PE熒光抗體， 在激光共聚焦顯微鏡下觀察， 發現細胞膜被染成紅色的γδ T細胞內分布有大量呈綠色熒光（FITC）細小散點物質(圖4)。

2.6 流式細胞術檢測活化的γδ T細胞攝入MtbSAg MtbHAg激活的γδ T細胞與FITCMtbSAg在37℃孵育時， 加入抗TCRγδ PE熒光抗體， 用流式檢測發現， MtbSAg攝入率即γδ T細胞中FITC+細胞百分數隨時間延長不斷增加。在孵育30、 60和90 min時， 攝入率分別為(26.68±3.58)%、 (48.09±3.29)%和(53.32±3.29)%; 但是在120 min時降低至(31.28±5.80)% (圖5)。

3 討論

為了探討多肽類抗原激活的人γδ T細胞是否也具有抗原提呈作用， 首先考慮是否有涉及抗原提呈細胞有關的表型分子的表達。本實驗采用多肽類的MtbHAg作為優勢激活γδ T細胞的抗原， 其中具有激活γδ T細胞效應的主要組分是Mr在10 000～14 000的非分泌性耐熱多肽［4， 5］。用這種多肽抗原激活的γδ T細胞在培養增殖到第11天時， 其表面HLADR和協同刺激分子(CD80和CD86)從培養前的低表達（1％～8％）顯著上調為高表達（62％～89％）， 表明這些細胞已具有抗原提呈細胞的表型。

Brandes等［3］發現IPP活化γδ T細胞攝入可溶性抗原后與初始αβ T細胞共同培養促使細胞增殖。本實驗中純化T細胞（幾乎均是αβ T細胞）與MtbSAg摻入的DC培養11 d后數量增加7倍， 而與MtbSAg摻入的活化γδ T細胞共同培養后， αβ T細胞的數量增加8倍。我們進一步用CFSE標記初始純T淋巴細胞后， 再與MtbSAg摻入的DC或γδ T細胞培養， 流式細胞術檢測后用Modfit軟件進行分析CD4+T細胞各代細胞所占百分率， 發現由活化γδ T細胞和成熟DC作為抗原提呈細胞的二組， 培養到晚期時增殖的細胞絕大多數均是集中在第9、 10代。說明引起CD4+T細胞增殖的能力幾乎相同。這些結果表明， 用MtbHAg活化的γδ T細胞和成熟DC一樣， 具有提呈可溶性抗原給初始T細胞， 引起CD4+T增殖的能力。這與 Brandes報道的用非肽類抗原刺激的γδ T細胞提呈可溶性抗原的結果相一致。

為了證實MtbHAg活化的γδ T細胞能攝入蛋白抗原， 本實驗將活化的γδ T細胞與FITC標記的MtbSAg在37℃的條件下孵育， 流式細胞術檢測顯示γδ T細胞攝入SAg的能力隨著時間的增加而增加（30 min 至 90 min）。同時， 在激光共聚焦顯微鏡下也觀察到γδ T細胞能將抗原攝入胞內。

綜上所述， 經MtbHAg活化γδ T細胞具有抗原提呈作用， 其功能活性似乎與成熟DC沒有明顯差別， 但γδ T細胞更容易獲取和體外操作。因此， 這種活化的γδ T細胞可在制備疫苗和免疫治療中成為新的目標［6］。

參考文獻

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［3］ Brandes M， Willimann K， Moser B. Professional antigenpresentation function by human γδ T cells［J］. Science， 2005， 309(5732): 264-268.

第3篇：細胞核的功能范文

【摘要】

目的: 本研究旨在探索紫杉醇、 順鉑誘導卵巢癌細胞凋亡后能否具有較強的免疫原性， 并可以被抗原提呈細胞交叉提呈并促進免疫應答。方法: 用巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)和白介素4（IL4）刺激人外周血單核細胞分化誘導為樹突狀細胞（DC）， 6 d后將DC和經紫杉醇聯合順鉑在體外誘導發生凋亡的人卵巢癌細胞株共同培養， 并以凍融細胞共培養DC組和單獨DC組作對照， 共培養4 h后， 進行激光掃描共聚焦顯微鏡觀察DC細胞對凋亡細胞的吞噬作用， 同時以流式細胞術(FCM)檢測不同培養組DC的分化和成熟程度。結果: 紫杉醇、 順鉑誘導的凋亡卵巢癌細胞可被DC有效吞噬， 與對照組相比， 凋亡組DCs的表達及成熟度均明顯增高， 并具有統計學意義（P﹤0.05）。結論: 紫杉醇、 順鉑誘導的凋亡卵巢癌細胞具有較強的免疫原性， 可以促進DC的分化和成熟。

【關鍵詞】 紫杉醇; 順鉑; 樹突狀細胞; 細胞凋亡; 抗原提呈

［Abstract］ AIM: To explore wheather apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatin could be crosspresented by antigen presenting cells and promote immune responses. METHODS: DCs were generated from peripheral blood monocytes in RPMI1640 supplemented with GMCSF and IL4. After 6 days’ incubation， DCs were further cocultured with either apoptotic HO8910 cell lines induced by paclitaxelcisplatin or control cells for four hours. Maturation of DCs was compared among different groups according to their surface markers through flow cytometry assay and their phagocytosis ability was evaluated by confocal microscopy scanning assay. RESULTS: Apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatincan were phagocytized more efficiently by DCs.Resulting is more cellularity and maturation of DCs in apoptotic cellinduced groups than control group(P

［Keywords］paclitaxel; cisplatin; dendritic cells; apoptotic cells; antigen presentation

化療藥物通過誘導凋亡來殺死腫瘤細胞， 而凋亡的腫瘤細胞是否具有免疫原性一直是倍受爭議的話題， 近來研究表明化療藥物誘導的凋亡腫瘤細胞能否有效激發免疫應答， 與腫瘤細胞的性質和化療藥物有關［1］。本研究旨在探索紫杉醇聯合順鉑化療藥物誘導卵巢癌細胞凋亡后的免疫原性， 探討誘導凋亡的腫瘤細胞能否被樹突狀細胞（dendritic cell， DC）交叉提呈， 從而促進免疫應答， 為臨床制定合理的化療聯合免疫療法治療腫瘤提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 紫杉醇、 順鉑購自山東齊魯制藥廠; 淋巴細胞分離液購自上?；瘜W試劑廠; 巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor， GMCSF)、 白介素4（interleukin4， IL4）、 腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα， TNFα）均購自R&D公司; CFSE(carboxyfluorescein succinimidylester)活細胞探針購自Invitrogen公司; 小鼠抗人抗體CD14、 CD80、 CD83、 CD86、 CD1a單克隆抗體(mAb)購自ebioscience公司; AnnexionⅤPI核酸染料購自深圳晶美公司; RPMI1640培養液、 2.5 g/L胰酶、 胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購自Gibco公司; 人卵巢癌HO8910細胞株為上海市免疫學研究所饋贈; 人濃縮白細胞由自愿者提供。

1.2 方法

1.2.1 人外周血細胞定向誘導分化和培養DC 取60 mL濃縮WBC， PBS稀釋至200 mL， 采用淋巴細胞分離液經密度梯度離心分離獲取外周血單個核細胞， PBS洗滌細胞2次， 細胞計數， 在6孔板中以無血清RPMI1640培養液懸浮細胞至密度為5×109/L， 置37℃、 50 mL/L CO2培養箱2 h后取出， 洗去懸浮細胞（收集備用）， 加入含GMCSF(100 μg/L)、 IL4(50 μg/L)和100 mL/L FBS的RPMI1640培養液誘導培養貼壁細胞， 第3天半量換液， 第6天收集懸浮細胞， 計數。

1.2.2 HO8910凋亡細胞的制備 將HO8910細胞按紫杉醇和順鉑不同的作用劑量和不同時間分組處理， 紫杉醇順鉑濃度分別為2.5～0.3 mg/L、 25～3 mg/L、 125～15 mg/L、 250～30 mg/L， 分別作用12 h、 24 h和36 h后， 用2.5 g/L胰酶消化貼壁細胞， 將細胞用PBS重懸至1×109/L， 取100 μL， 以藥物未處理組為空白對照， 參照Annexin VPI試劑盒說明書檢測各組細胞的凋亡率。

1.2.3 HO8910凍融抗原制備 收獲HO8910細胞， 用PBS重懸至2×1010/L， 置液氮內10 min， 取出后速投入37℃水浴溶解， 反復5次。以3 000 r/min離心10 min， 收集上清， -80℃保存備用。

1.2.4 DC與凋亡細胞激光共聚焦掃描 消化對數增長期HO8910細胞株， 以PBS 重懸細胞至1×109/L， 加入CFSE終濃度為25 μmol/L， 50 mL/L CO2、 37℃培養箱共孵育30 min， RPMI1640培養液洗滌細胞1次后， 用含100 mL/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640液重懸細胞， 并鋪板培養。次日加入紫杉醇和順鉑（濃度為250～30 mg/L）， 培養24 h（此條件為1.2.2步驟實驗得出誘導細胞凋亡的最佳濃度和時間）后取出， 收集懸浮細胞， 計數。凋亡細胞與培養6 d后的DC以1∶1比例共孵育， 以未處理細胞為對照， 按相同比例和DC共培養， 4 h后取出， 用PBS洗滌細胞， 加入小鼠抗人PECD83抗體， 共孵育30 min后， 用PBS洗滌細胞， 并用40 g/L多聚甲醛固定懸浮細胞， 置于細胞甩片機中1 000 r/min離心3 min， 將細胞固定于載玻片上， 500 mL/L甘油PBS封片， 激光共聚焦顯微鏡檢測。

1.2.5 不同類型腫瘤抗原負載DC表面標志的檢測 DC培養至6 d， PBS沖洗收獲所有的DC， 分為3組進行實驗: 空白組， 單純DC組; 凍融組: HO8910凍融抗原負載DC組; 凋亡組: 紫杉醇順鉑誘導HO8910凋亡細胞負載DC組。共培養4 h后洗滌細胞， 用100 mL/L FBS1640懸浮細胞， 并加入TNFα至100 μg/L， 培養24 h后流式細胞術(FCM)檢測DC細胞表面CD1a、 CD14、 CD80、 CD83、 CD86的表達。

1.2.6 統計學分析 計量資料以x±s表示， 采用SPSS11.5數據包方差分析， P

2 結果

2.1 紫杉醇順鉑誘導人卵巢癌細胞株HO8910凋亡最佳時間與劑量的選擇 為確定紫杉醇和順鉑聯合誘導人卵巢癌細胞株HO8910的最佳作用劑量和最適作用時間， 我們選取了4個作用濃度和3個作用時間點（見前）處理HO8910細胞， 結果顯示紫杉醇順鉑作用濃度為125～15 mg/L， 作用時間12 h后細胞凋亡開始明顯增加， 以250～30 mg/L濃度作用24 h細胞基本完全凋亡。顯微鏡下可見作用24 h后， 細胞呈懸浮狀， 部分細胞胞膜不完整。作用36 h后FCM檢測結果顯示細胞大多呈壞死狀態， 顯微鏡下觀察發現細胞呈碎片。上述結果表明， 紫杉醇和順鉑聯合誘導HO8910細胞凋亡時， 濃度250～30 mg/L， 作用24 h為凋亡最適劑量、 最佳時間點效應（圖1）。

圖1 紫杉醇/順鉑作用不同濃度與不同時間細胞的凋亡比例（略）

Fig 1 The percentage of apoptotic cells induced by Paclitaxel/Cisplatin at different concentrations and time points

a: 125 paclitaxel+15 mg/L cisplatin for 12 h; b: 250 paclitaxel+ 30 mg/L cisplatin for 24 h; c: 250 paclitaxel+30 mg/L cisplatin for 36 h.

2.2 外周血單核細胞來源的DC的體外誘導 經常規貼壁法獲得外周血單核細胞后， 采用通用的GMCSF和IL4條件培養基體外誘導分化DC， 培養3 d后， 在倒置光學顯微鏡下觀察可見細胞開始呈集簇生長， 部分細胞的細胞膜有突起， 培養至第6天， 可見大部分細胞懸浮生長， 胞體大且外形不規則， 細胞膜呈樹突狀突起， 胞質豐富， 并具有典型DC形態（圖2）， 表明細胞已向DC分化， 可用于進一步表型分析和功能檢測。

圖2 倒置顯微鏡下DC的形態特征（略）

Fig 2 The morphology of induced DC observed with inverted microscope(×400)

2.3 誘導DC細胞的表型檢測 外周血來源的單核細胞經GMCSF和IL4誘導培養6 d后， 獲得未成熟的DC細胞， 采用單獨TNFα作用、 TNFα﹢凍融細胞和TNFα﹢凋亡細胞培養24 h后， FCM檢測DC表面標志的表達。結果顯示條件培養第6天較培養前CD14的表達明顯下降， CD1a、 CD80、 CD86的表達上調， CD83的表達為10%左右（圖3）。培養7 d后單獨TNFα作用和TNFα+凍融細胞作用后CD83表達約35%左右， 兩者間無統計學意義（P>0.05）， 但其在TNFα﹢凋亡細胞作用后表達上升為50%， 且與前兩者間有統計學意義（P

圖3 誘導前、 GMCSF/IL4、 GMCSF/IL4/TNFα誘導后細胞表面標志變化（略）

Fig 3 Alteration of surface markers on preinduced monocytes， GMCSF/IL4 induced and GMCSF/IL4/TNFα induced DC cells

表1 不同腫瘤抗原刺激后DC表面標志的表達（略）

Tab 1 Comparative analysis of surface markers on DC pulsed with different types of tumor antigens

aP

2.4 凋亡細胞可以被DC細胞有效的吞噬 比較DC與凋亡的HO8910細胞和未處理HO8910細胞共培養后， DC對兩類細胞的吞噬情況， 結果顯示（圖4）僅在凋亡組中可見DC膜與凋亡細胞融合、 DC細胞胞體內有凋亡小體、 小顆粒狀溶解碎片等一系列DC吞噬凋亡細胞的現象， 而DC對正常的HO8910無吞噬作用。進一步通過FCM檢測DC吞噬凋亡細胞在時相上是否存在差異， 結果表明隨共培養時間延長， DC的吞噬未見增加， 4 h與24 h之間無統計學意義。

圖4 DC對凋亡腫瘤細胞、 未處理的腫瘤細胞吞噬的激光共聚焦掃描（略）

Fig 4 Phagocytosis of dendritic cells against apoptotic and normal HO8910 cell lines

A: Apoptosis HO8910 cell lines; B: HO8910 cell lines.

3 討論

卵巢癌死亡率極高， 減少卵巢癌復發、 提高預后的一個重要策略是在手術和化療后再應用如免疫治療、 分子靶向治療和基因治療等鞏固療法［2］。近年來研究表明化療藥物誘導的凋亡腫瘤細胞能夠有效激發免疫應答［3］。如果能將卵巢癌免疫治療與傳統治療方法合理聯合將為卵巢癌的治療開辟新的途徑、 帶來新的曙光。研究證明腫瘤免疫逃逸的機制不僅由于缺乏抗原， 而且與抗原不能被有效提呈給T細胞而不能產生特異性免疫應答有關［4］。因此腫瘤免疫治療的一個巨大挑戰是如何使抗原被有效提呈而激發有效的抗腫瘤免疫應答。如果化療誘導的凋亡細胞具有免疫原性、 能被APCs提呈則是化療聯合免疫治療的基礎。

Nowak等［5］學者發現二氟脫氧胞嘧啶核苷介導的凋亡細胞不是耐受原， 凋亡細胞能誘導DC成熟并激活相關的T細胞。另有學者發現化療誘導的凋亡腫瘤細胞數目增加， 使得APCs吞噬作用加強， APCs被激活后釋放更多的前炎性細胞因子， 從而促進APCs對腫瘤抗原的交叉提呈［6］。而Casares等［7］發現絲裂霉素C致凋亡的腫瘤細胞不具有免疫原性。上述研究結果提示， 不同腫瘤細胞經不同化療藥物作用后， 其免疫原性仍然存在不確定性。紫杉醇和鉑類是目前國內外公認的卵巢癌一線化療藥物， 本實驗中應用紫杉醇聯合順鉑誘導卵巢癌細胞株凋亡后， 論證凋亡細胞對DC的影響。應用激光共聚焦顯微鏡發現與凋亡細胞共培養的DC胞內見吞噬凋亡小體， 且DC胞體中出現小顆粒狀溶解碎片， 而DC對正常HO8910無吞噬作用。同時FCM檢測發現與凋亡細胞共培養的DC， 其共刺激分子表達較空白組和凍融組顯著升高， 因此相同數量凋亡腫瘤細胞的免疫原性強于凍融腫瘤抗原， 表明DC通過吞噬負載凋亡細胞后其成熟度的表達明顯增加， 行使抗原提呈的功能顯著增強。本實驗結果證明紫杉醇+順鉑誘導的凋亡卵巢癌細胞并不隔離抗原， 相反使交叉提呈的腫瘤抗原性顯著增加， 促進了DC的成熟與提呈作用。

此外， 本研究中還有一個發現， 即凍融組在加凍融抗原前后， DC的共刺激分子表達無明顯改變， DC未被凍融抗原活化。我們認為部分原因有可能是由于加入凍融抗原的效價過低， 但更可能是來源于HO8910的凍融腫瘤抗原本身不具有誘導異體DC活化的抗原表位， 但凋亡組加凋亡細胞后， DC的共刺激分子表達改變明顯。本研究認為應用凋亡的細胞作為抗原可能不需要識別腫瘤特異性肽段和受MHC限制， 化療誘導的凋亡細胞有望成為免疫治療的自身抗原， 這些對于DC疫苗的制備及化療聯合免疫治療提供了重要的信息。

腫瘤的免疫治療規范化是一個尚未解決的問題， 如何將免疫治療與傳統的化療結合起來更是一個空白的領域。越來越多的研究認為化療誘導的凋亡細胞促進免疫應答反應。因此如何將免疫治療與化療合理結合將是今后致力研究的課題， 本課題為此研究提供了重要理論依據。

參考文獻

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第4篇：細胞核的功能范文

關鍵詞：包裝設計;實用功能;審美價值

中圖分類號：J0 文獻標志碼：A 文章編號：1673-291X（2014）31-0024-02

包裝設計是人類文化活動的重要組成部分，體現了人類心智的積極、創造。在中國當代包裝設計發展的實踐進程中，尤其是在信息時代多元文化語境對中國包裝設計的圍合影響下，把握和堅持包裝設計的文化性，挖掘、整理中國包裝設計中優秀豐富的文化內涵，將傳統的文化思想精髓同當代設計的要素有機結合起來尤為重要。

一、功能的實用價值

商品的包裝強調對客戶需要的滿足，而產品正是滿足消費者需要的組合體，而不單單是實體的組件。還包括消費者對虛榮心的滿足、對名譽、威望的獲取以效用的增進等等。良好的包裝能增加產品的功能、擴大產品的效用，成為產品不可缺少的一部分。包裝設計，涉及到功能、材料和形式三個方面的因素。設計師的創造能力，都體現于對這三個要素的良好的處理之中。三個要素中，功能決定形式，功能是主導因素。商品包裝舉具有以下三個功能：

1.保護功能

保護功能是包裝最基本的功能，即使商品不受各種外力的損壞。一件商品，要經多次流通，才能走進商場或其他場所，最終到消費者手中，這期間，需要經過裝卸、運輸、庫存、陳列、銷售等環節。在儲運過程中，很多外因如撞擊、潮濕、光線、氣體、細菌等因素，都會威脅到商品的安全。因此，作為一個包裝設計師，在開始設計之前，首先要想到包裝的結構與材料，保證商品在流通過程中的安全。

2.便利功能

所謂便利功能，也就是商品的包裝是否便于使用、攜帶、存放等。一個好的包裝作品，應該以“人”為本，站在消費者的角度考慮，這樣會拉近商品與消費者之間的關系，增加消費者的購買欲，對商品的信任度，也促進消費者與企業之間溝通。很多人購買易拉罐裝的飲料時，都喜歡開蓋時的那一聲“啪”帶來的。

3.銷售功能

人們常說“酒香不怕巷子深”、“一等產品、二等包裝、三等價格”，只要產品質量好，就不愁賣不出去。在市場競爭日益強烈的今天，營銷推廣的作用與重要性也為廠商深諳。人們已感覺到“酒香也怕巷子深”。如何讓自己的產品得以暢銷，如何讓自己的產品從琳瑯滿目的貨架中跳出，只靠產品自身的質量與媒體的轟炸，是遠遠不夠的。

在各種超市與自選賣場如雨生春筍般而起的今天，最直接面向消費者是產品自身的包裝。好的包裝，能直接吸引消費者的視線，讓消費者產生強烈的購買欲，從而達到促銷的目的。

正如人們常說的 “包裝是沉默的商品推銷員”。如今，很多聰明的廠商與廣告策劃公司，都把包裝列為企業的4P策略之一（Position市場、Product產品、Package包裝、Prices價格）。把包裝融入CI之中，在推銷產品的同時，也提升了自身的企業形象。

總之，功能的實用價值是包裝設計的最根本屬性，一旦失去了其實用價值，任何設計都失去了其存在的意義。

二、藝術的審美價值

1.包裝設計的綜合性

包裝涉及知識范圍很廣泛，對設計師而言現代社會的消費是―個極富挑戰的境地，不能用舊的觀念來做現代的設計。因此，設計師除了天賦資質之外，創造的關鍵是敏感，要對商品、商店、市場和其他流通環節的親身體驗和科學的考察，并不斷接觸變化中的商業態勢，深入理解對產品的設計要求、設計定位，然后再依靠高度的創作沖動，獲取設計靈感。全面的包裝設計，需對包裝裝飾與包裝結構有所側重，跨出傳統的專業設計的范疇，同時兼備的社會和科學職能所具有的較高的科技知識和文學修養所支配著，這樣才能運籌帷幄、自如地解決好商品包裝的綜合表達能力。

在現代包裝設計上，我們提倡大膽創新，要適合現代人的不同層面的精神和情感等因素的需要，敢于冒險而尋求新突破，注重個性體現不同類別的商品設計，從多角度、多方面地創造出與內容相適應的現代包裝藝術形式，在技法上允許不同手法交互使用，在印刷上盡取不同工藝之所長。因此，對于工藝制作的選擇是保證包裝藝術質量的關鍵。包裝設計師不僅要意識到而且要準確地、綜合和靈活地運用現代技術，以使現代包裝設計藝術給人以豐富的聯想和美感，并且能具備可欣賞的、具有高品味、時代感和吸引力的整體形象的獨立性，從而讓人們在購買商品時得到審美的美學價值。

2.包裝設計的獨特性

商品包裝要突出藝術個性。個性即矛盾的特殊性，人們對現實的審美意識具有無限豐富的多樣的個性差異，藝術的發展需要創造，而藝術創造的價值則寓于個性之中，每個藝術種類的個性是它區別于其他藝術種類的獨特本質特點。包裝設計也是同樣，商品在流通時必須通過包裝來進行區別。同類的或不同類的商品依靠其獨特的包裝設計來被消費者識別認定最終認可而購買。

包裝設計也要有強烈的視覺沖擊力。在琳瑯滿目的商品世界中，唯有亮麗的色彩，與眾不同的圖案造型，生動地展現產品個性形象，才能使消費者一見鐘情。

現代設計講求破除規矩、平板的格式，講究富于創造性的、生氣勃勃的審美感已成為一種潮流，以往煩瑣綺麗的風格已被現代設計中簡潔、大方、明快的格調所取代，給人們在忙碌的生活中得以放松，從而吸引消費者的注意，給消費者以審美愉悅，激發購買欲，所有這些正是包裝設計的獨特性所帶來的效應。

利用包裝設計的獨特性開拓市場之路、引領市場消費作用不可低估，大有文章可做。

3.包裝設計的欣賞性

任何成功的藝術都富有美的價值，而美的藝術必須服務于現實生活，因為每一個藝術作品的產生都包括藝術取材、美的想象和表達，這是客觀表現與藝術內容構成的需要。包裝設計的藝術特點就是要表現內在的本質，而美必須符合實用、經濟和準確，迅速傳遞商品信息的原則?，F代包裝在設計上更關注情感，關注家庭，營造生產氛圍，這已成為現代包裝設計審美特性的一項重要內容?？傮w來看，這一系列包裝，注重實用與審美的統一，設計上更多關注是美學價值的含量，即在統一中求變化，在變化中又有一種完善的整體感，呈現出雅致而高貴的宣染力和優美而深沉的歷史文化感。這種變化不僅是人類的富足表現，也是提高人類精神需要的表現，包裝所體現的民族風格和時代氣魄的美，具有了一定的珍藏價值和欣賞意義。

4.包裝設計的傳播性

包裝設計還具有其審美的傳播性。在現代激烈競爭的市場環境中，好的包裝設計不僅能讓廠商獲得豐厚的利潤和效益，而且還能使消費者在購買商品使用價值的同時得到美的享受。應該說，商品的外表包裝是商品走向市場的必要組成部分。它是直接與顧客相識的首當其沖的因素，消費者正是通過它傳達的相關文字、圖形、色彩信息，直觀有效地認識和把握商品品質的優劣，本身與商品性質的適合度，做出是否喜愛和購買的決策。

包裝設計的流行滲透著審美觀念的流行。包裝設計歸根到底是人的設計;是以人的需要為主要功能的設計;是植根于自身的歷史背景、文化傳統和民族精神的設計，真正流行與審美的設計是真實、科學、合理的設計。包裝設計的根本原則是藝術性與功能性的完美結合，任何脫離或有悖于功能性的所謂藝術性，都將失去其存在的意義;任何只注重功能性而沒有藝術性的設計，也喪失了包裝設計的藝術靈魂。我們要真正做到藝術性與功能性的完美結合，充分發揮出包裝設計的實用功能和審美價值，創造出更大的商業和文化價值。

參考文獻：

[1] 黃俊彥，邢浩.現代商品包裝視覺傳達設計[J].包裝世界，2005，（3）.

[2] 鄭秀敏.淺議現代包裝設計[J].甘肅農業，2005，（9）.

第5篇：細胞核的功能范文

【摘要】

目的 觀察新診斷老年糖尿?。―M）患者胰島β細胞功能特點及其與胰淀素、褪黑素的關系。方法 收集初診DM患者60例，其中老年DM組27例，成年DM組33例，對照組30例。均行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），計算胰島β細胞功能指數（HOMAβ）。采用ELISA法檢測患者空腹血清胰淀素、褪黑素水平。同時測定所有受試者的血脂、體重指數（BMI）和腰臀比（WHR），并對結果進行統計分析。結果 （1）老年DM組與成年DM組比較HOMAβ明顯降低〔(58.20±24.89) vs (81.20±40.80)，P

【關鍵詞】 糖尿病；老年；胰島β細胞功能；胰淀素；褪黑素

老年糖尿?。―M）與成年DM比較具有起病隱匿、癥狀不典型、進展緩慢等特點，其發病原因尚不明了，胰島β細胞功能下降是其發病的主要機制之一。胰淀素和褪黑素是分別由胰腺和松果腺分泌的老年相關激素，近年國外有些研究表明胰淀素、褪黑素與老年DM的發生有一定的關系〔1，2〕。本研究通過口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），分析老年DM患者的胰島β細胞功能特點；并檢測老年DM患者血清胰淀素、褪黑素的濃度，進一步探討兩種老年相關激素與胰島β細胞功能的關系。

1 對象與方法

1.1 對象

病例組60例，為2007年10月至2009年8月期間在我院內分泌科住院及門診新診斷的2型糖尿病（T2DM）患者，年齡25～94歲，均未接受胰島素治療，符合下列標準：（1）行OGTT后均符合1999年WHO T2DM的診斷標準；（2）空腹胰島素（Fins）≥5 μIU/ml；（3）空腹血糖（FPG）≤10 mmol/L。（4）谷氨酸脫羧酶抗體、胰島細胞自身抗體均陰性。按發病年齡分為兩組，老年DM組（≥60歲）27例，男14例，女13例，平均年齡（74.59±8.79）歲，成年≥組（25～59歲）33例，男17例，女16例，平均年齡（45.76±8.54）歲。健康老年對照組30例，選擇同期健康體檢者，年齡、性別與老年糖尿病組相匹配，無吸煙史，排除糖尿病、糖耐量減低、冠心病、高血壓、腦血管病及腫瘤等疾病。

1.2 方法

1.2.1 標本收集

所有受試者對本試驗知情。老年健康體檢者在禁食12～14 h后，在無應激情況下采空腹肘靜脈血。60例DM人均做OGTT及胰島素釋放試驗，清晨空腹取靜脈血后一次性口服75 g葡萄糖，并分別于0.5、1、2、3 h后取靜脈血做血糖及胰島素測定。所有收集的血液分離出血清，于-70 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 檢測指標

采用OLYMPUS AU540全自動生化分析儀測定血清甘油三酯（TG）、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）和血清葡萄糖（GLU）。胰島素(INS)測定采用電化學發光免疫法，試劑由羅氏公司提供，儀器：電化學發光免疫法測定儀2010Elecsys。胰淀素、褪黑素測定采用ELISA，應用美國R&D公司試劑盒（板內板間變異系數均小于10%），按說明書操作。腰圍、臀圍、身高、體重由專人測定。

1.2.3 計算指標

體重指數（BMI）=體重（kg）/身高2（m2）。腰臀比（WHR）=腰圍（cm）/臀圍（cm）。按HOMA模型計算胰島素抵抗指數〔HOMAIR=(Fins×FPG)/22.5〕及胰島β細胞功能指數〔HOMAβ=20×Fins/(FPG-3.5)〕。

1.3 統計學分析

所有數據統計采用SPSS13.0軟件進行，連續性計量資料以x±s表示，非正態分布的資料以對數轉換成正態分布后輸入。兩組間比較采用獨立t檢驗 ，計數資料比較采用χ2檢驗。相關分析采用直線相關分析。

2 結 果

2.1 各DM組OGTT各點血糖、胰島素值的比較

老年DM組OGTT 2 h血糖及胰島素值均高于成年DM組（均P

2.2 各組研究對象的臨床指標比較

老年DM組與成年DM組比較，HOMAβ、TG均明顯降低（P

2.3 老年糖尿病組HOMAβ與其他指標的相關性

在老年DM組內，HOMAβ與褪黑素呈明顯正相關（r=0.403，P=0.016），與胰淀素(r=-0.461，P=0.003)、HOMAIR(r=-0.238，P=0.009)呈明顯負相關，與FPG、INS、TG、WHR則無明顯相關性，見表3。表3 老年糖尿病組胰島β細胞功能與其他指標的相關性(略)

3 討 論

胰淀素，又稱胰島淀粉樣多肽（IAPP），在胰島β細胞和胰島素一起表達、合成、分泌，被認為是胰島素的孿生兄弟，各種影響胰島素分泌的因素同時也影響胰淀素的分泌。本研究結果顯示，老年DM組血清胰淀素水平明顯高于老年健康組，與國外〔3〕的研究結果相一致。相關分析還顯示HOMAβ與胰淀素、HOMAIR呈明顯負相關，說明增高的胰淀素可能是老年糖尿病患者胰島素分泌缺陷的一個重要原因。胰淀素之所以能夠導致胰島功能受損，一方面可能由于胰淀素能抑制胰島素的釋放，提高血漿游離脂肪酸的水平，抑制肌肉組織對葡萄糖的攝取，抑制肝細胞對葡萄糖的利用和促進葡萄糖的產生而誘導胰島素抵抗的發生。另一方面，胰淀素可自我聚集、變性、沉積在胰島β細胞內，通過直接的氧化作用，在細胞膜形成特異性鈣離子通道，增加P53和P21的表達等機制引起胰島β細胞的損傷和凋亡，導致胰島β細胞絕對數目的減少〔4〕，使胰島素分泌最終減少。

通過抑制胰淀素的代謝異常、阻止胰淀素的聚集或拮抗其作用，均具有抗老年糖尿病的潛力。以胰淀素為作用靶點的藥物將可能成為治療老年糖尿病的全新手段。

褪黑素，N乙酰5甲氧基色胺，是色氨酸的衍生物。近年研究表明其是迄今已知的最強的自由基清除劑，能對抗氧化應激，對DM及其并發癥有一定的治療作用〔5，6〕。Ha等〔7〕通過實驗證明褪黑素在分子水平上對血糖有穩定作用，并進一步推斷老化使內源性褪黑素水平下降，可能與老年DM的發生發展有關。本文亦發現，老年DM組血清褪黑素水平明顯低于健康對照組，進一步說明了衰老導致的褪黑素水平下降可能為老年DM發生的原因之一。經相關分析，本文還發現HOMAβ與褪黑素呈正相關。大量的動物及人體試驗也證明褪黑素能夠降低血糖，對胰島β細胞具有保護作用〔8，9〕。

綜上，胰淀素、褪黑素均與老年糖尿病胰島β細胞功能有一定的相關性，但具體的分子機制目前尚不清楚，仍有待進一步深入研究。由于本研究樣本量有限，還需進一步擴大樣本量更深入了解胰淀素、褪黑素與老年DM胰島β細胞功能的相互關系，從而尋求有效預防及治療老年DM的新途徑。

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第6篇：細胞核的功能范文

關鍵詞: 腎病綜合征;受體，白細胞介素2;T淋巴細胞;免疫，細胞

摘 要:目的 觀察原發性腎病綜合征（PNS）患者細胞免疫功能變化. 方法 采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清可溶性白細胞介素2受體（sIL-2R），流式細胞儀測定外周血T細胞亞群（CD3+ ，CD4+ ，CD8+ ）及紅細胞C3b受體花環（RBC-C3b RR）和紅細胞免疫復合物花環（RBC-ICR）試驗. 結果 原發性腎病綜合征組sIL-2R明顯高于對照組［（398±122）vs（202±84）pmol?L-1 ，P

+ ，CD8+ 較對照組明顯降低（0.50±0.08）vs（0.71±0.07），（0.26±0.07）vs（0.36±0.07），（0.22±0.05）vs（0.31±0.06），P

Keywords:nephrotic syndrome;receptors，interleukin-2;T-lymphocytes;immunity，cellular

Abstract:AIM To investigate cellular immune function and　erythrocyte immune function in patients with primary nephrotic syndrome（PNS）.METHODS Soluble interleukin2receptors（sIL-2R）were detected by ELISA.T-lympho-cyte subsets（CD3+ ，CD4+ and CD8+ ）were also evaluated by flow cytometry（FCM）.The red blood cell C3b receptor rosette（RBC-C3b RR）and the red blood cell immune com-plexs rosette（RBC-ICR）were measured.RESULTS Serum sIL-2R levels were significantly higher in PNS than in normal controls ［（398±122）vs（202±84）pmol?L-1 ，P

0 引言

研究發現，機體免疫功能的異?；蛭蓙y是引起腎臟疾病的基礎［1，2］ ，它在腎臟疾病的免疫發病機制中的作用日益受到重視［3，4］ .我們通過檢測原發性腎病綜合征（PNS）患者血清可溶性白細胞介素2受體（sIL-2R），T細胞亞群及紅細胞免疫功能，旨在探討PNS患者細胞免疫功能變化的意義.

1 對象和方法

1.1 對象 PNS患者40（男22，女18）例，年齡16～64（平均40）歲，均為住院患者，通過實驗檢查及臨床確診.對照組20（男13，女7）例，年齡20～40（平均30）歲，血、尿常規及肝腎功能正常.

1.2 方法

1.2.1 血清SIL-2R的測定 采用雙抗體夾心ELISA法，試劑盒由第四軍醫大學免疫學教研室提供，具體操作步驟按說明書進行. 1.2.2 T細胞亞群的測定 取抗凝全血100μL，分別加10μL FITC標記抗CD3、抗CD4、抗CD8和IgG鼠單抗混勻，室溫放置15min后，用QPREP自動細胞制備儀（Bekmn-coulter公司產品），加ABC液溶解紅細胞和穩定淋巴細胞，輕輕搖蕩10min立即用ProfileⅡ型流式細胞儀（美國Coullter公司產品）分析，所用激光光源為15mW氫離子激光，波長為A488nm ，檢測1000個以上細胞.

1.2.3 紅細胞免疫功能的測定 采用C3b 受體花環（RBC-C3b RR）和紅細胞免疫復合物花環（RBC-ICR）試驗（第四軍醫大學免疫學教研室提供）.預備試驗:將補體致敏的酵母和未致敏的酵母凍干試劑，按說明書要求溶解、洗滌，配制成1×1011 個?L-1 的密度;另取患者末梢血或肝素125kU?L-1 抗凝血1滴，加入2mL生理鹽水，每次經2000r?min-1 離心3min后，配制成1.25×1010 個?L-1 密度的紅細胞懸液.

吸取致敏酵母菌懸液與未致敏酵母菌懸液各50μL，分別加入試管中，混勻，置37℃水浴中30min后取出涂片，加2.5g?L-1 戊二醛1滴，輕輕混勻，自然干燥，進行姬姆薩染色，用油鏡（Olympus，日本產）觀察.1個紅細胞上結合兩個或兩個以上酵母菌者為1個陽性花環細胞，共計數200個紅細胞，計算出RBC-C3b RR和RBC-ICR的百分率（%）.

統計學處理:實驗數據以x ±s表示，兩組間比較采用t檢驗，用SPLM統計軟件包進行統計分析.

2 結果

2.1 sIL2R及T淋巴細胞亞群的變化 PNS患者外周血sIL-2R水平較對照組明顯增高，有顯著差異（P

+ ，CD8+ 較對照組明顯降低，有顯著差異（P

表1 sIL-2R及T淋巴細胞亞群的變化　略

2.2 紅細胞免疫功能的變化 PNS患者RBC-C3bRR明顯低于對照組，有顯著差異（P

表2 紅細胞免疫功能的變化　略

3 討論

PNS是由原發性腎臟病引起，并非是細菌等致病因子直接侵犯腎臟引起，而是與免疫反應相關，當致病的抗原進入人體后，被吞噬細胞攝取，淋巴細胞對這些抗原進行識別引起免疫反應，造成腎小球損傷.目前已證實是一組免疫介導性疾?。?］ .T淋巴細胞亞群是構成機體免疫系統的重要因素，體內免疫平衡是通過輔T細胞CD4+ 和抑制性T細胞CD8+ 形成的T細胞網絡來維持調節免疫功能的平衡［6］ ，二者的升高與降低，均可使兩者的比例失調，導致機體免疫功能的異?；蛭蓙y［7］ .免疫學研究證實，紅細胞具有抗原提呈細胞作用，能促進T細胞的免疫功能，擴大細胞免疫效應，參與細胞免疫調控［8］ ，并能清除體內的免疫復合物，促進吞噬細胞的吞噬功能，調節體液免疫和細胞免疫，粘附自身的T細胞，增強T細胞免疫功能，更有效地清除免疫復合物［9］ .本資料顯示PNS患者血清sIL-2R水平明顯高于對照組（P

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第7篇：細胞核的功能范文

【摘要】 目的 觀察連枷胸犬胸壁加壓包扎、肋骨牽引和手術內固定的治療效果。方法 實驗用Beagle犬24只，隨機分為A組(對照組)、B組(包扎治療組)、C組(牽引治療組)和D組(手術固定組)，每組6只，建立大面積(15cm2/kg)浮動胸壁動物摸型。用MPA動物肺功能記錄儀、血氣分析、胸腔置管等觀察犬呼吸頻率(RR)、潮氣量(Vt)、每分鐘靜息通氣量(VE) 、肺順應性(CL)、氣道阻力(Raw)、動脈血氧分壓(PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動脈血氧飽和度(SaO2)、剩余堿(BE)及胸膜腔內壓(IPP)等變化，比較胸壁加壓包扎、肋骨牽引固定和手術內固定的治療效果。結果 浮動胸壁模型完成后，均出現反常呼吸，胸膜腔內壓負壓絕對值減小(P

【關鍵詞】 連枷胸；生理學；肋骨骨折；牽引術；包扎；內固定

Abstract： Objective To study curative effect of pressure dressing on chest wall，traction and internal fixation on pulmonary function in dogs with flail chest.Methods A total of 24 Beagle dogs were set up as great floating thoracic wall models(15cm2/kg)， then pided into internal fixation group，rib skeletal traction group，pressure dressing group and control group randomly，with 6 dogs in each group.The change of respiratory rate(RR)，tidal volume(Vt)，minute ventilation(VE)，lung compliance(CL)，airway resistance(Raw)，partial pressure of oxygen in artery (PaCO2)，partial pressure of carbon dioxide in artery(PaCO2)，arterial oxygen saturation(SaO2)，base excess(BE)，intrapleural pressure(IPP) were observed and recorded by MPA pulmonary function recorder and blood gas analysis.At last the therapeutic effect was compared among 4 groups.Results Paradoxical respiration occurred；intrapleural pressure decreased(P

Key words：flail chest;physiology;rib fracture;traction;dressing；internal fixation

連枷胸是最嚴重的胸壁損傷，其病死率達12%～50%［1］。對連枷胸浮動胸壁固定治療，其固定方法的選擇與對連枷胸所牽涉的復雜的病理生理的認識密切相關。近年來，國內外學者大多認為連枷胸所致的呼吸困難主要是由肺挫傷和反常呼吸引起［2］ 。筆者通過動物實驗，排除肺挫傷的影響。觀察大面積浮動胸壁對犬呼吸功能的影響以及胸壁加壓包扎、肋骨牽引和手術內固定治療的作用。

材料與方法

1 動物分組與模型建立

試驗用Beagle犬24只，體重為(10.32±1.56)kg。用3%戊巴比妥鈉(25mg/kg)靜脈注射麻醉，氣管插管后在右側胸部相應面積(15cm2/kg)肋骨的兩端切開胸壁皮膚，各游離肋骨3cm，保持胸膜完整，切斷并剪去肋骨1cm，以確保損傷區域的胸壁能隨呼吸自由浮動，縫合切口。模型制成后，隨機分為4組，每組各6只犬（雌雄不拘）。A組為對照組，不進行治療干預；B組為包扎治療組：以浮動胸壁為中心，選用相應大小的厚棉墊加壓包扎，使浮動胸壁極度內陷，進而消除反常呼吸；C組為牽引治療組：行肋骨巾鉗懸吊牽引固定，牽引重量為0.5～1kg，以正好對抗反常呼吸運動為宜；D組行手術切開復位，鋼板＋螺絲釘內固定治療。上述3種治療方法，在治療過程中均需保持胸膜腔完整。

2 觀察指標

對實驗犬行全麻氣管插管后，氣管插管外接MPA動物肺功能記錄儀，測呼吸頻率（RR）、潮氣量(Vt)、每分鐘通氣量(VE)、肺順應性(CL)、氣道阻力(Raw)。于術側腋中線第8肋間置胸腔管，接MPA動物肺功能記錄儀測胸膜腔內壓（IPP），適時記錄測量結果。采抽取動脈血測動脈血氧分壓(PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動脈血氧飽和度(SaO2)、剩余堿（BE）、SB等。分別記錄模型建立前、制模1小時、A組制模4小時、B、C、D組模型建立后4小時的上述觀察指標。

3 數據處理

所測數據經SPSS 13.0統計軟件，采用多個樣本均數間的多重比較的統計學方法（SNKq）進行統計學分析。

結 果

浮動胸壁模型完成后，24只犬均出現胸壁反常運動，浮動幅度2～3cm。胸膜腔內壓負壓絕對值減小(P

討 論

1 連枷胸行胸壁固定治療的理論依據

胸壁的完整性對呼吸功能的維持有重要作用。連枷胸肺容量的減少主要是胸壁不穩及肺挫傷所致的纖維化導致。通常將連枷胸分類為前外側區和后外側區，兩種類型均包含側面區域，該區有反映呼吸力學的前鋸肌指狀突的插入。Borrelly等［3］報道前鋸肌在連枷區錯位復雜的病理生理過程中有重要作用，當涉及肩關節活動或作為吸氣肌時，連于每根肋骨上的前鋸肌指狀突有如拉抽屜一樣使連枷區錯位，使其向后上方移位，由此產生肋骨斷端重疊，并會導致傷者肺容量減少的惡性循環。外科手術固定骨折肋骨可有效防止或中止肋骨錯位的惡性循環，早期復位和固定骨折肋骨，恢復胸壁的幾何形狀，保持胸壁的完整性，避免了因胸壁變形對肺功能的損害。Voggenreiter等［4］證實了對無肺挫傷連枷胸患者首先行手術治療的重要性。據Clark等［5］統計31％的孤立性肺挫傷患者需要機械通氣治療，而57％的孤立性連枷胸患者需要機械通氣治療，再次強調了胸壁機械性完整性的重要作用。

2 胸壁加壓包扎固定的治療效果

20世紀初期對連枷胸采用捆綁固定的方法進行治療，當時認為包扎固定可增加胸壁穩定性、減少疼痛和可能有助于咳嗽。本實驗結果表明，在大面積連枷胸包扎固定后與對照組比較，IPP、Raw、RR顯著升高（P

3 牽引固定的治療效果

肋骨牽引固定是過去臨床常用于浮動胸壁的一種方法，認為牽引固定后連枷胸側胸壁的幾何形狀可恢復，胸腔容積可增加，牽引固定保持了胸壁的完整性，避免了因胸壁變形對其下肺區域的壓迫，從而能產生足夠的潮氣量。本實驗結果表明：與對照組比較，牽引治療后Vt、Raw顯著升高（P0.1）。說明牽引治療后實驗犬的潮氣量雖有部分增加，但IPP、PaO2、PaCO2、SaO2、BE、CL、VE、RR變化不明顯，其低氧狀態未能得到有效改善。這主要是因為大面積浮動胸壁形成后，牽引固定雖能部分改善通氣，但由于牽引外力持續作用于傷側胸壁，對抗其彈性回縮，被牽引的浮動胸壁無法與健側胸壁進行協同呼吸運動，無法恢復肋骨生理狀態杠桿作用，胸廓生理狀態的完整性未能得以恢復，肺的順應性改善不明顯，故呼吸功能仍不能恢復正常，缺氧狀態無法得到有效改善。所以，至少對于大面積連枷胸來說，單純行牽引固定無法達到滿意療效。

4 手術內固定的治療效果

1975年Richardson等［6］首次報道了用鋼絲修復胸骨骨折的方法。連枷胸手術內固定可有效地減少機械通氣時間和ICU時間，減少肺炎的發病率及降低病死率，恢復胸壁的幾何形狀及生理狀態的完整性，恢復肋骨生理狀態杠桿作用，提高傷側肺的順應性，進而改善呼吸功能。本實驗結果表明，與對照組比較，手術內固定治療后PaO2、PaCO2、SaO2、CL、Vt、VE顯著升高（P

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第8篇：細胞核的功能范文

【摘要】 目的：探討他克莫斯（tacrolimus， FK506）對大鼠骨髓源性樹突狀細胞(DCs)分化、成熟和免疫學活性的影響. 方法：收集大鼠骨髓源性DCs，加入不同濃度的FK506進行培養，采用流式細胞術行DCs表型分析，ELISA法檢測培養上清中IL12 的水平并行體外混合淋巴細胞反應（MLR），觀察DCs對同種T細胞的刺激能力. 構建大鼠腎移植模型，于移植前7 d輸注FK506處理的DCs，觀察移植腎存活時間. 采用ELISA法檢測MLR培養上清和移植大鼠血清中TH1/TH2細胞因子IFNγ，IL2，IL4 和IL10的表達水平. 結果：FK506對DCs表面分子(Iad，CD80和CD86)的表達無明顯影響(P>0.05)，而IL12的分泌水平降低(P

【關鍵詞】 他克莫斯; 樹突狀細胞; 免疫耐受; 器官移植

【Abstract】 AIM: To investigate the effect of tacrolimus (FK506) on the differentiation， maturation and function of rat bone marrowderived dendritic cells (DCs). METHODS: We added tacrolimus at concentrations of 5-20 μg/L to the DCs culture and checked the expressions of activation markers (Iad， CD80 and CD86) by flow cytometry， the release of cytokines IL12 by ELISA and the stimulatory capacity of the resulted DCs by mixed lymphocyte reaction (MLR). Thirty Wistar rats were pided into 3 groups (n=10 in each): group A accepted kidneys from SD donors; group B was infused with DCs derived from SD donors 7 d before transplantation; group C was the same as that in group B except the DCs were treated with tacrolimus during culture. The functions of the transplanted kidneys were evaluated by urine volume and ELISA was used to detect the levels of Th1/Th2 cytokines， such as IFNγ， IL2， IL4 and IL10 in the MLR and in the sera of the recipients 7 d after culture or transplantation. RESULTS: Even at the stimulation of lipopolysaicharide (LPS)， in the tacrolimustreated culture， we observed no significant effects on the expressions of activation markers (Iad， CD80 or CD86). The release of IL12 and the stimulatory capacity of tacrolimustreated DCs were reduced， compared with control DCs (P

【Keywords】 tacrolimus; dendritic cells; immune tolerance; organ transplantation

0引言

樹突狀細胞(dendritic cells， DCs)是專職性抗原遞呈細胞(antigenpresent cell，APC)，它與效應T 細胞的相互作用決定著免疫應答的發生(激活/耐受)及強度. 近年來，DCs在移植免疫耐受誘導、自身免疫性疾病和變態反應性疾病的治療等方面展現出獨特的應用價值［1］. 我們觀察了他克莫斯（tacrolimus， FK506）對骨髓源性DCs成熟與免疫功能的影響，初步探討FK506在免疫應答早期抗原提呈過程中的作用.

1材料和方法

1.1材料

健康雄性Winstar大鼠和SD大鼠，體質量250～350 g（上海斯萊克公司），在無特定病原體(specific pathogenfree， SPF)環境中飼養. FK506（日本藤澤制藥公司）；重組粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rGMCSF)與外源性脂多糖(LPS)（Sigma公司）；RPMI 1640培養基及胎牛血清（Gibco公司）；PE標記的小鼠抗大鼠Iad，CD80，CD86 mAb（eBioscience公司）；IL12，IL4，IL10，IL2， IFNγ的ELISA試劑盒（Bender公司）；3HTdR（Amersham Life Science公司）. EpicXL型流式細胞儀(美國BeckmanCoulter公司).

1.2方法

1.2.1骨髓來源DCs的提取與鑒定參照文獻［2］的方法，取SD大鼠（供者）股骨，沖洗出骨髓細胞，以1∶10的體積比加入37℃預溫的TrisNH4Cl去除紅細胞；加GNK緩沖液終止反應，離心洗滌2次；用RPMI 1640調細胞密度為1×109/L，37℃， 50 mL/L CO2條件下培養2 h；輕輕洗去非粘附細胞；在貼壁細胞中加入含10 μg/L rrIL4和10 μg/L rrGMCSF的RPMI 1640完全培養基，37℃， 50 mL/L CO2條件下培養6～7 d，收集生長狀態良好的DCs備用.

1.2.2DCs表型與分泌IL12水平分析將DCs分成4組，每組設3復孔：① 對照組(DCs組)；② FK506處理組(FK506DCs組)：培養液中加入不同濃度FK506（5， 10， 20 μg/L）；③ 脂多糖刺激組(LPSDCs組)：在培養結束前18 h加入100 μg/L LPS；④ FK506處理+脂多糖刺激組(FK506LPSDCs組). 在37℃， 50 mL/L CO2條件下培養7 d，收集培養上清液，ELISA方法檢測IL12水平（按試劑盒說明書進行）. 收獲細胞（2×109/L）；分別加入PE標記的抗Iad， 抗CD80或抗CD86 mAb(終濃度5 mg/L)，4℃作用45 min；流式細胞儀分析，以中位熒光強度（MFI）作為檢測指標.

1.2.3體外混合淋巴細胞反應(MLR)分析取Winstar大鼠（受者）脾臟，制備無菌脾細胞懸液；過尼龍毛柱獲取非粘附的T 淋巴細胞作為反應細胞，37℃， 50 mL/L CO2條件下培養1 h，調細胞密度為1×109/ L. 以25 mg/L絲裂霉素滅活SD大鼠DCs（DCs；LPSDCs；FK506DCs）作為刺激細胞( 2×108/L)，37℃， 50 mL/L CO2條件下培養30 min；刺激細胞/應答細胞( S/E) 以不同濃度比(1∶5， 1∶10， 1∶20)加入96孔細胞培養板中，總反應體積為200 μL，含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養基培養72 h；于培養結束前18 h每孔加入3HTdR 3.7×104 Bq；β計數儀測量待測細胞的3HTdR摻入值(cpm).

1.2.4大鼠腎移植模型的建立與分組以SD大鼠為供體、Wistar大鼠為受體，參照文獻［3］加以改進，采用腎動脈與腹主動脈端側吻合、腎靜脈cuff套管法吻合、供體膀胱瓣與受體膀胱吻合. 將受者Wistar大鼠分為3組，每組10只.① 對照組(A組)；② DCs 組(B組)：腎移植術前7 d自大鼠尾靜脈注入DCs 細胞懸液0.5 mL (4×109/L)；③ FK506DCs 組(C組)：腎移植術前7 d注入FK506DCs細胞懸液0.5 mL (4×109/L). 術后于代謝籠內培養，觀察大鼠移植腎存活情況，出現無尿即認為移植腎臟失功能.

1.2.5Th1/Th2細胞因子測定在體外MLR中，加入3HTdR前收集培養上清；動物實驗中，移植7 d后抽取受鼠尾靜脈血并分離血清，ELISA試劑盒說明書分別檢測IFNγ， IL2， IL4和IL10 水平.

統計學處理： 應用SPSS 10.0軟件包進行數據處理， 兩組間比較采用隨機分組t檢驗方法， 多組間比較采用單因素方差分析方法， 以P

2結果

2.1DCs表型分析FK506DCs組Iad，CD80和CD86的表達水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05). LPS刺激后，Iad，CD80和CD86的表達顯著增加，與未處理組比較差異有統計學意義(P0.05，表1).表1他克莫斯(FK506)和外源性脂多糖(LPS)對DC表面分子表達的影響 (略)

2.2DCs分泌細胞因子IL12檢測在DCs培養的第7日，FK506DCs組培養上清中的IL12水平分別為: 5 μg/L組(105.0±9.5) ng/L；10 μg/L組（74.4±6.6） ng/L； 20 μg/L組（41.7±3.9） ng/L. 明顯低于DCs組的(176.8±19.7) ng/L (P

2.3DCs對同種T 細胞MLR檢測LPS刺激活化的DCs可以誘導T細胞活化，FK506處理的DCs促進T細胞增殖的能力明顯受到抑制，與對照組比較差異有統計學意義(P

2.4移植物的存活時間對照組移植腎臟的存活時間(6.3±0.7) d與DCs組 (7.2±1.4) d比較，差異無統計學意義，FK506DCs組移植腎臟的平均存活時間延長至(19.0±2.3) d，同另兩組比較差異有統計學意義(P

2.5Th1/Th2細胞因子檢測在體外MLR（圖3）和動物實驗（圖4）中，FK506處理DCs組與DCs組比較，IL2，IFNγ水平均明顯降低(P

3討論

近幾年，DCs在移植免疫耐受中的作用逐漸受到重視［1］. DCs是目前發現的功能最強的APCs［4-5］，也是唯一能夠激活初始型T 細胞啟動初次免疫應答的APCs，調節免疫激活/耐受的平衡［6］. 從上世紀九十年代初開始，FK506作為免疫抑制劑應用于器官移植領域，因為其強效、低毒性等特點，在短短的十幾年臨床應用過程中，以FK506為基礎的免疫抑制方案已經逐步超過以環孢霉素為基礎的免疫抑制方案，成為臨床器官移植免疫抑制的首選藥物. 迄今為止，對FK506免疫抑制效應的理解集中在其對T淋巴細胞的負性調節作用，既抑制T 淋巴細胞的增殖和免疫效應因子如IL2，IFNγ等的分泌. 最近有研究表明［7-9］，FK506也能夠影響DCs的成熟和功能，在免疫應答早期既抗原提呈過程中發揮作用.

我們用大鼠骨髓造血干細胞成功地誘導出DCs，并在體外觀察FK506對DCs細胞表型和刺激T細胞活化增殖能力的影響. 發現FK506并不影響DCs表面共刺激分子CD80，CD86和MHCII類分子Iad的表達，這些分子是DCs成熟的標志. 在實驗中加入LPS刺激加速了DCs的成熟過程，而FK506對這一過程同樣無抑制作用，提示FK506并不影響DCs的成熟過程. IL12是DCs成熟過程中分泌的一種主要的效應細胞因子，能促進Th0細胞分化為Th1細胞，從而誘導Th1型細胞介導的免疫反應. FK506處理DCs的IL12分泌水平明顯降低， 即使加入LPS刺激后IL12的分泌也無明顯增加， 提示FK506抑制DCs的抗原提呈功能可能是通過降低IL12的分泌來完成.

在體外混合淋巴細胞培養中，FK506處理的供者來源的DCs，可明顯抑制T 淋巴細胞的增殖與活化，并呈現為劑量依賴關系. 在大鼠體內實驗中，FK506DCs回輸給受者后可明顯延長移植物存活時間. FK506DCs回輸作為一種簡單易行的方法，更易于進入移植臨床，雖然應用FK506誘導免疫耐受尚有待研究，但至少可以降低移植受者術后免疫抑制劑用量，減少藥物的毒副作用. 在體外MLR和動物體內實驗中，均發現經FK506處理的DCs可顯著降低Th1亞群淋巴細胞分泌的細胞因子水平，而Th2亞群細胞因子的分泌水平顯著提高，表明FK506處理的DCs能抑制T淋巴細胞向Th1的分化，并誘導其向Th2分化，這可能是移植物長期存活的主要或至少是相關的重要因素. IL10在體內外表達水平的差異說明體內環境遠較體外復雜，這可能是某些效果明顯的體外研究，進入臨床卻不盡人意的原因之一. 在臨床實踐中，部分器官移植受者在因為各種原因的免疫抑制劑裁撤過程中表現出特異的免疫無反應性，我們推測，FK506對DCs的影響可能在這一現象中發揮作用.

總之，探討FK506對抗原呈遞細胞、特別是DCs的作用，必將加深和完善對FK506免疫抑制作用機制的理解，使其更合理的應用于臨床，而FK506表現出的誘導免疫耐受的作用也為免疫耐受的誘導方法提供一個全新的切入點.

基金項目：福建省自然科學基金（C0510033）

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第9篇：細胞核的功能范文

[關鍵詞] 精神分裂癥；細胞免疫；T淋巴細胞亞群；白介素

[中圖分類號] R749.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2013）02（c）-0012-03

近年來，精神分裂癥的免疫功能學逐漸成為了精神病學界的研究熱點，神經-內分泌-免疫系統之間的相互作用、相互調節關系日益受到重視。大量研究結果表明，精神分裂癥患者很可能存在病毒感染與自身免疫系統的問題。電針治療是指在刺入人體穴位的毫針上，采用電針機通以微量低頻脈沖電流的一種治療方法，目前在臨床上已得到廣泛的應用，且取得了較好的治療效果[1-6]。目前，電針治療應用于慢性精神分裂癥患者的報道并不多見。所以，為了檢驗電針合并抗精神病藥物治療對慢性精神分裂癥患者免疫功能的影響，特進行此次研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患者均來自呼和浩特市康復醫院連續性住院的慢性精神分裂癥患者（即經過兩種以上藥物系統或間斷性治療而無效、且排除其他軀體障礙者）。實驗時間從2009年6月～2010年2月。根據DSM-IV有關精神分裂癥的診斷標準，隨機選取無嚴重軀體疾病及自身免疫性疾病、無煙酒嗜好和藥物濫用、非妊娠和哺乳期的慢性精神分裂癥患者65例，并分為藥物治療組和針藥治療組。藥物治療組患者34例，其中，男20例，女14例；年齡19～63歲，平均（44.2±10.1）歲；病程5～38年，平均（19.5±9.5）年。針藥治療組31例，其中，男18例，女13例；年齡20～58歲，平均（40.4±8.5）歲；病程 5～37年，平均（15.8±8.8）年。兩組患者年齡和病程等一般情況比較差異均無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。其中藥物治療組患者于實驗第1周及第4周脫落2例，針藥治療組于第2周脫落1例。

1.2 方法

1.2.1 藥物治療組 選用氯氮平治療，劑量150 mg/d，1次/d，每晚口服，治療觀察時間為6周。

1.2.2 針藥治療組 除應用上述藥物治療外，每日針灸1次，并使用電針儀輔助治療，時間為20 min/次，電量以患者能承受的最大電量為度；選取百會、印堂、四神聰、膻中等穴位，治療觀察時間為6周。選用長2寸的針具，手法為平補平泄。

1.3 臨床評估

在治療開始前及治療第6周后，由2名經過專業培訓的主治醫生采用簡明精神量表（BPRS）、陰性癥狀量表（SANS）、陽性癥狀量表（SAPS）評定所有被試者的精神癥狀[7-8]。

1.4 實驗室檢測

所有被試均在治療前1 d及治療第6周后早晨6～7點取空腹靜脈血5 mL，運用流式細胞術測定T淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8；采用 Elisa法測定白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）水平。CD3、CD4和CD8試劑盒以及流式細胞儀均由BD公司提供；IL-2和IL-6試劑盒由 Beckman公司提供。所有樣本均由同一名人員測定，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計學方法

所有數據均采用SPSS 17.0統計軟件包進行處理與分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組療效評定比較

兩組患者在治療6周后的BPRS、SAPS和SANS量表得分顯著低于治療前（P < 0.01）。針藥治療組治療6周后BPRS、SAPS和SANS量表得分顯著低于藥物治療組（P < 0.01）。見表1。

2.2 兩組治療后臨床量表的減分率比較

經過6周的治療后，針藥治療組的臨床量表評分減分率顯著大于藥物治療組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表2。

2.3 T淋巴細胞亞群檢測比較

針藥治療組的CD4的水平在治療后顯著高于藥物治療組（P < 0.05），其他因子組間比較差異均無統計學意義（均P > 0.05）。見表3。

2.4 兩組治療前后IL-2、IL-6水平的比較

兩組患者治療前血清IL-2、IL-6比較差異無統計學意義（均P > 0.05）；治療后針藥治療組血清IL-2、IL-6水平顯著低于藥物治療組（P < 0.05、P < 0.01）。見表4。

2.5 安全評估

試驗期間，兩組患者均未出現不良反應。

3 討論

隨著細胞免疫學的發展.有關精神分裂癥患者細胞因子及其受體的研究已成為精神神經免疫學中較為活躍的領域之一。很多研究證實精神分裂癥患者存在免疫功能的異常，并且具有自身免疫性疾病的特點，主要是CD3、CD4、IL-2和IL-6的改變與中樞神經遞質的異常，尤其是多巴胺能神經元功能亢進，這些變化主要是通過神經-內分泌-免疫網絡相互影響。但三者之間的改變何為初始原因，何為繼發因素尚難判斷，故對精神分裂癥進行免疫學研究有助于揭示其病理機制。

以往的一些研究表明[9-15]，額葉-紋狀體-丘腦-顳葉回路的功能紊亂是精神分裂癥的病理性基礎之一，其中尤以海馬、杏仁核的功能紊亂為主；免疫學的研究表明IL-2在上述回路中具有較高的代謝和合成密度。因此，增高的IL-2 水平將對上述這些大腦解剖部位產生特異性的影響，從而引起一系列神經遞質（如DA 、5-HT、Ach和NE等）的改變， 導致了精神分裂癥患者精神癥狀和認知功能障礙。另外，IL-2能增加多巴胺能神經傳遞并且參與自身免疫和細胞生長。腦脊液中IL-2的濃度比兒茶酚胺代謝物與疾病復發的關系更緊密。本研究發現藥物合并電針治療組精神分裂癥患者血清IL-2水平均顯著低于低于藥物組，且藥物合并電針治療組各臨床量表減分率大于藥物組。說明電針合并藥物治療可以更好的降低IL-2水平，從而緩解精神分裂癥癥狀與既往研究相似[19-20]。

IL-6是臨床免疫學研究較多的細胞因子之一。既往研究證實DA和5-HT的功能受到IL-6的影響[4-6]。原因是產生IL-6 的淋巴細胞膜上有DA受體和5-HT受體存在，而這可明顯提高額前葉與海馬的DA和5-HT的活性與濃度。因此，可以說由IL-6濃度或活性的增高所引起的免疫功能的調節紊亂及其所促發的免疫損傷很可能是精神分裂癥的主要影響因子之一[21]。而在本實驗結果中，針藥治療組的IL-6的水平顯著低于藥物治療組且藥物合并電針治療組的BPRS、SPAS、SANS臨床量表評分較治療前均下降。這說明通過電針治療可能抑制了IL-6的生成，從而對精神分裂癥的免疫功能紊亂進行了糾正，使精神癥狀有所緩解。

目前，從對精神分裂癥患者T細胞亞群進行的大量研究中可以看出，精神分裂癥患者的外周血中確實存在著T細胞比率顯著下降的狀況，而輔T淋巴細胞CD4細胞的降低可能是引發這一改變該的主要原因。所以，可以推測，精神分裂癥患者體內的β-內啡肽是明顯增多的，而β-內啡肽具有降低CD3和CD4細胞的作用，導致精神分裂癥患者免疫功能紊亂或降低。此外，也有研究表明，激活的T細胞分泌的IL-2會反過來作用于T細胞使其擴增，而IL-2與其受體的高親和力結合能使CD4細胞達到完全活化狀態。但若是高濃度的IL-2持續對CD4細胞產生過量的信號刺激則會誘發CD4細胞啟動凋亡程序，進而導致CD4 以及CD3等免疫細胞的數量降低等。在本實驗結果中，針藥治療組治療后血清的CD4水平顯著高于治療前和高于藥物治療組，與上述研究結果是一致的[3，5]。

大量的研究資料表明[16-17]，針灸能改變機體的特異和非特異性免疫功能，對免疫細胞和免疫分子均有明顯的影響。針灸的免疫效應主要表現在經其穴位刺激后能夠引起局部的神經或感受器將其傳入中樞神經系統，進而刺激神經中樞釋放神經遞質等一系列變化，最終實現調控機體免疫功能的作用。此外，針灸引起機體交感-腎上腺髓質系統的興奮，促使其釋放兒茶酚胺及阿片類物質等，進而作用于相應受體產生免疫反應。有研究表明，脾虛泄瀉模型的大鼠外周血中CD3、CD4和CD8細胞減少，而經針灸天樞穴后其CD3和CD4細胞數量均有所回升，且CD4/CD8比值也升高。本實驗結果中針藥組CD4水平治療后高于治療前，也高于藥物組，差異都有統計學意義，與多數研究結果一致[22-25]。

本研究結果顯示，經過兩種不同方法的治療，針藥組血清CD4水平高于藥物組，血清IL-6、IL-2水平低于藥物組。針藥組BPRS、SAPS、SANS臨床量表評分減分率均高于藥物組，針藥組較藥物組臨床癥狀緩解明顯。電針合并藥物治療對精神分裂癥癥狀的緩解作用優于單純藥物治療組：即電針在改善精神分裂癥癥狀的同時可更好地調節與精神分裂癥癥狀相關的細胞免疫因子水平。

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