基因工程載體的種類精選(九篇)

前言：一篇好文章的誕生，需要你不斷地搜集資料、整理思路，本站小編為你收集了豐富的基因工程載體的種類主題范文，僅供參考，歡迎閱讀并收藏。

第1篇：基因工程載體的種類范文

基因工程在醫學上已得到廣泛應用，并且應用領域不斷被拓寬，取得了令人驚喜的成就。

1 基因工程制藥

基因工程制藥開創了制藥工業的新紀元，解決了過去不能生產或者不能經濟生產的藥物問題。現在，人類已經可以按照需要，通過基因工程生產出大量廉價優質的新藥物和診斷試劑，諸如人生長激素、人的胰島素、尿激酶、紅細胞生成素、白細胞介素、干擾素、細胞集落刺激因子、表皮生長因子等。令人振奮的是，具有高度特異性和針對性的基因工程蛋白質多肽藥物的問世，不僅改變了制藥工業的產品結構，而且為治療各種疾病如糖尿病、腎衰竭、腫瘤、侏儒癥等提供了有效的藥物。眾所周知，醫治侏儒癥的良藥是人生長激素，倘若從人的尸體中獲取，治療一個病人就需要600具尸體的腦下垂體才能獲得足夠的量；倘若運用基因工程生產，就可從每升基因工程菌液中得到2．4g。人們為此而石破天驚的興奮!成本如此之低，又如此之高產，其巨大的經濟效益和社會效益，由此可見。

2 基因工程抗病毒疫苗

為人類抵御病毒侵襲提供了用武之地。基因工程乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗、流行性出血熱病毒疫苗、輪狀病毒疫苗等應用于臨床，提高了人類對各種病毒病的抵御能力。比如，乙型肝炎病毒疫苗的問世，使我國新生兒不再遭遇乙型肝炎病毒的侵襲，也降低了人群肝癌的發病率。又如，為治愈癌癥正在研制的用單克隆抗體制成的“生物導彈”，就是按照人類的設計，把“生物導彈”發射出去，精確地命中癌細胞，并炸死癌細胞而不傷害健康的細胞。就單克隆細胞而言，單克隆細胞在腫癌的診斷檢測、顯示定位、監測病變、監測療效等方面也有重要價值。人類還通過基因工程生產抵御各種病菌、血吸蟲、虐原蟲等疫苗，提高人體對各種傳染病的免疫力。脫氧核糖核酸或者基因疫苗的問世，變革了機體的免疫方式。如今，人們翹首關注困擾人類的艾滋病病毒(人類免疫缺陷病毒)疫苗的早日問世。基因工程抗體技術的發展，為克服單克隆抗體生產細胞株在生產過程中的不穩定性，為生產大量高效抗病毒疫苗提供了先進的生產工藝。

3 基因工程治療疾病

臨床實踐已經表明，基因治病已經變革了整個醫學的預防和治療領域。比如，不治之癥——白癡病，用健康的基因更換或者矯正患者的有缺損的基因，就有可能根治這種疾病。現在已知的人類遺傳疾病約有4000種，包括單基因缺陷和多基因綜合征。運用基因工程技術或者基因打靶的手段，將病毒的基因殺滅，插入校正基因，得以治療、校正和預防遺傳疾病的目的。人類精心設計的基因工程操作，克服了不同個體甚至物種之間由于器官移植所產生的免疫排斥作用，實現人體之間的移植已獲成功，成功的實體器官移植有腎、心、肝、胰、肺、腸，也有雙器官和多器官的聯合移植。而人體與動物之間的器官移植成為現實，臨床應用已是指日可待的事了。脫氧核糖核酸化學合成的完善和自動化，脫氧核糖核酸擴增技術的優化，為合成基因“探針”，提高臨床診斷的質量，是人類所殷切企盼的。基因治療有兩種途徑，一是體細胞的基因治療，二是生殖細胞的基因治療。體細胞的基因治療是將正常的遺傳基因導入受精的卵細胞內，讓這種遺傳物質進入受精卵的基因組內，并隨著受精卵分裂，分配到每一個子細胞中去，最終糾正未來個體的遺傳缺陷。而生殖細胞的基因治療是將人類設計的“目的基因”導入患有遺傳病病人的生殖細胞內，此法操作技術異常復雜，又涉及倫理，緩行之理充足，故尚無人涉足。

4 基因工程診病

第2篇：基因工程載體的種類范文

關鍵詞：基因工程;實驗室建設;管理

中圖分類號：G647 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）41-0270-02

實驗室是高校開展大學生和研究生實驗教學的主要場所，也是高校教師開展科學研究的重要平臺，是一所大學教學、學科建設和管理水平的重要體現（袁繼紅等，2011）。通過實驗室開展的實踐教學是培養學生動手能力、創新能力以及理論聯系實際的基本途徑。基因工程是現代生命科學研究領域中一門極其重要的學科，我校生命科學學院開展的基因工程教學主要依托農業生物工程研究院的科研平臺進行，對基因工程教學實驗室進行建設和管理，期望達到教學、科研資源共享的目的。為此，以科研平臺建設的是教學實驗室有其不同于常規單一教學實驗室的管理模式，能使大學生有更多的機會了解學科前沿和實際研究狀況，在驗證性實驗的基礎上融進創新性實驗內容。經過幾年的實踐探索，在提高參與實驗學生動手能力及培養創新思維發揮了重要作用，尤其是對進一步攻讀相關專業碩士學位或博士學位的學生更具有意義。

一、基因工程實驗室的實驗內容與教學目標

基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術、遺傳工程或DNA重組技術等，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，以改變生物原有遺傳特性，獲得新品種，生產新產品的現代生物學技術。以基因工程操作步驟為主線，含有目的基因分離、克隆，載體構建、轉化、篩選鑒定等實驗內容，設置和選擇實驗內容時既要注重專業性和可操作性，又要突出先進性和系統性。在通過課堂學習理論以后，需要通過實驗對基因工程理論有系統、明確的認識，達到熟識、理解并掌握DNA重組的原理和實際操作方法，并在實踐中提高分析問題和解決問題的能力，開拓創新能力，為學習相關專業課程以及從事生物技術相關領域的科學研究奠定基礎。

我們所建設的基因工程教學實驗室進行教學的目標是培養高年級本科生及研究生進行基因操作的能力。在教學中，我們以問題導向，充分調動教、學雙方的主觀能動性，積極組織學生參與實驗的準備工作;在實驗中，安排學生與教師共同討論實驗涉及的理論問題和實驗內容可能應用的問題，指導學生分析總結實驗結果和存在的問題。以培養學生興趣為主，發展一批從事基因工程研究的后備力量，據不完全統計，繼續深造讀研的學生占總人數的30%以上。

二、構建實驗體系，全面提高學生實驗技能

基因工程實驗內容主要包括基因獲得、載體構建、基因導入、基因表達4個方面，但在進行實驗教學時，往往不是完全直接以此4個方面開展實驗。通過幾年的本科基因工程實驗教學經驗，逐漸形成了以基因工程經典性、基礎性實驗為主，強調實驗的連續性，并結合植物基因工程實驗室研究設計實驗。我們的做法是：

1.基因的獲得，主要采用從克隆載體上酶切獲得目標基因、通過PCR擴增目的基因、人工合成DNA序列。在基因分離、克隆這部分知識的實驗室驗證教學中，往往是安排“基因組DNA分離提取技術”、“RNA分離提取技術及cDNA反轉錄技術”、“基因酶切與DNA的瓊脂糖電泳技術”、“PCR技術”、“電泳膠回收DNA技術”。

2.載體構建。這部分實驗內容和基因獲得部分是難以分開的，常常是將酶切后電泳回收的目標基因、RNA反轉錄的cDNA、人工化學合成的基因序列、PCR擴增的DNA序列構建在亞克隆載體上、或構建目標基因在表達載體上。這部分實驗室教學內容主要有“載體構建技術”、“基因連接技術”等。

3.目的基因導入。根據受體細胞不同導入方法也不同，包括感受態細胞的制備、農桿菌介導轉化法，基因槍法（或微彈轟擊法），花粉管通道法以及顯微注射技術等，結合本實驗室研究內容，以植物細胞為主，利用農桿菌介導轉化法，以模式植物煙草為受體材料，通過組織培養再生實驗獲得轉目的基因煙草植株。

4.目的基因在宿主基因組上的整合、表達、檢測及轉基因生物的篩選，實驗內容包括報告基因的組織化學染色、PCR擴增目的基因、southern blot、Northern blot、Western Blot等實驗內容涵蓋了基因工程的主要操作過程和內容，可使學術全面掌握基因工程技術。

結合本實驗室特點，設置4個實驗內容，包括DN段得連接、轉化及酶切鑒定，農桿菌介導的植物遺傳轉化，轉化植物的表型分析及鑒定，轉基因植物的性狀分析及基因表達產物提取和檢測。從2006年開始，已經培養生物技術及生物科學專業的本科生600余人。

三、加強“物、教師、學生”管理，全面提高實驗教學效率

儀器設備是基因工程實驗得以開設的基礎，本實驗室儀器設備總值達到2394余萬元，完全具備開展基因工程實驗所需硬件條件。在實驗過程中需要使用大量儀器，包括PCR儀、離心機、電泳儀、凝膠成像系統、恒溫水浴鍋等，種類繁多，價格昂貴，學生很容易因為不當操作導致儀器損壞，導致維修經費開支巨大，因此“物”的管理顯得尤為重要，必須嚴格建立實驗儀器臺賬，利用儀器管理軟件對儀器出入庫、維修及報廢等做好記錄，便于對每臺儀器隨時跟蹤管理。嚴格按照“賬、物、卡”管理，每臺儀器責任到人，做好使用登記，定期組織老師對儀器進行排查和維護，保證學生實驗的順利開展。

教師和實驗技術人員是實驗教學的實施者，在注重培養學生獨立開展實驗的能力的同時，教學中要引導學生注意理論知識與實驗內容的結合，要講解清楚實驗內容的基本原理、操作的關鍵步驟，甚至要指出可能的誤操作引起的問題。因此教師和實驗技術人員業務水平非常重要，目前本實驗室已有從事基因工程教學工作教師10人，均獲得博士學位，專職實驗技術人員9人（含博士1人，在讀博士3人）。

學生作為實驗教學的主體，在實驗設置時應充分考慮學生的水平和接受程度，要鼓勵學生按照操作步驟進行實驗操作，也要要求學生清楚每一步操作步驟的理論原理以及所使用儀器的基本性能和操作標準規程，才能完成好實驗內容的學習，對于出現的問題能夠有自己的見解。只有做到“物、教師、學生”三者的有機結合，才能提高基因工程實驗教學質量。

四、展望

基因工程是一門新興的學科，由于基因概念較為抽象，單憑課堂講解很難完全掌握該門課程的理論基礎和操作技術，需要開展相應實驗教學，印證課堂教學內容，通過課堂教學-實驗教學-知識回顧，才能真正理解基因工程技術的精要內容。

參考文獻：

[1]袁繼紅，李香花，朱意，付家忠.高校生化與分子生物學實驗室建設與管理的實踐[J].中國現代教育裝備，2011，（11）.

[2]趙宏霞，王金平.關于強化實驗室建設與工作管理的思考[J].農業基礎科學，2009，（15）.

[3]王文娟，朱俊華，尹芳，張雪丹.“分子生物學實驗”課程教學改革的實踐與探索[J].北京城市學院學報，2010，（3）.

[4]崔芳，孟麗，支濤.電子顯微學實驗室建設及發展的思考[J].中國校外教育，2010，8.

[5]李開智，肖勝軍，郭芳.病理學創新性實驗教學初探[J].山西醫科大學學報（基礎醫學教育版），2007，9（4）.

[6]劉幸福，吳元喜.在實驗教學中試行“以學生為主體”的教學模式探討[J].實驗技術管理，2002（3）.

[7]謝青，楊廣笑.分子生物學創新性實驗教學的實踐與探索[J].實驗室科學，2008，（5）.

[8]李敏，李堅斌，梁興泉.淺談大學生創新實驗[J].廣西大學學報（哲學社會科學版），2009，31（增刊）.

[9]張文利，徐躍飛，董旭.醫學本科留學生的生物化學實驗教學[J].教育論壇，2008，13（5）.

[10]曹朝暉，龍石銀，胡小波.把握專業特色提高生物化學實驗教學質量[J].醫學教育探索，2008，7（4）.

Discussion for the Construction and Administration of Genetic Engineering Laboratory in University

ZHAO Dan1，ZHAO De-gang1

（“The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region（Ministry of Education），Institute of Agro-Bioengineering and College of Life Sciences，Guizhou University， Guiyang， Guizhou Province 550025”）

第3篇：基因工程載體的種類范文

關鍵詞：木糖篩選系統；木糖異構酶；蔬菜；遺傳轉化

轉化效率低和轉基因食品安全性問題一直是制約蔬菜基因工程育種的2個主要因素。在植物的遺傳轉化中，人們將植物細胞對不同糖類分解代謝能力的差異，作為篩選劑的正向選擇系統得以發展，并在安全標記基因方面顯示出巨大的應用潛力。

1?蔬菜遺傳轉化的研究現狀及存在問題

隨著植物基因工程技術的不斷發展和完善，人們對蔬菜基因工程育種的研究日益增多，在蔬菜抗病、抗蟲、改善品質及提高產量等方面取得了階段性進展。

在目前的轉基因技術中，對轉化植株進行篩選往往采用抗性選擇標記，如抗生素類或除草劑類抗性基因等。轉基因植株一旦再生成功，這些抗性標記基因常與目的基因共轉化并整合到植物基因組中，由此引發環境和食品安全性問題[1-2]；且在抗性選擇劑的作用下，轉化細胞成活下來，非轉化細胞被殺死，因其在逐漸凋亡過程中能夠分泌毒素或生長抑制劑，進而造成轉基因體系的轉化效率低[1]。鑒于這些情況，培育出轉化效率高的生物安全標記基因的轉基因植物，已成為目前基因工程的重要目標。

2?基于糖代謝相關基因的正向選擇系統

2.1?糖代謝相關基因種類及選擇優勢

安全標記基因是對生態環境和人類健康相對安全的標記基因。研究較多的生物安全標記基因主要是與糖類代謝相關的基因，如磷酸甘露糖異構酶基因（pmi）、木糖異構酶基因（xylA）和核糖醇操縱子（rtl）等[3]。與糖代謝相關基因的轉化系統不是將非轉化細胞殺死，而是導入特定的基因使轉化細胞具備特定的代謝優勢或利用特定的物質，使之生長旺盛，從而達到篩選效果[4]。與常規標記基因不同，糖代謝相關基因具有以下優點：這些標記不具有抗性，基因本身及表達產物無毒副作用，因此不必擔心環境安全和人類健康等問題；轉化體系有利于植株再生，轉化率高[5]。目前應用較多的是磷酸甘露糖異構酶基因，已廣泛用于水稻、玉米、小麥、甜菜、棉花和番茄等植物轉化系統[1]。近年來，木糖異構酶基因也得到初步應用。

2.2?木糖選擇系統的篩選機理及應用

木糖異構酶基因（xylose isomerase gene，xylA），來源于紅色鏈霉菌、高溫厭氧芽孢桿菌，編碼木糖異構酶基因，能催化D-木糖與D-木酮糖的互變異構（圖1）[6]。

許多植物細胞可利用木酮糖作為主要碳源，但不能利用木糖。在含木糖的篩選培養基上，整合有外源xylA基因的細胞產生木糖異構酶能催化木糖異構為D-木酮糖，經磷酸戊糖途徑分解代謝，為轉化細胞生長所利用，而非轉化細胞則因碳饑餓而不能正常生長[7]。用食品工業中常用的木糖作為植物轉化細胞的篩選標記是安全的。

Haldrup等[8]首先應用D-木糖作為選擇劑在煙草遺傳轉化上獲得成功。韋正乙應用來源于大腸桿菌的木糖異構酶基因作為選擇標記基因，建立了農桿菌介導的基于木糖選擇系統的百脈根轉化體系。實驗對比了木糖篩選系統和除草劑篩選系統，在時間方面，木糖選擇系統獲得轉基因再生苗要比除草劑篩選系統縮短10 d以上[9]。

3?木糖篩選系統在蔬菜遺傳轉化上的應用

以木糖作為篩選劑的無抗性選擇標記技術是目前轉基因研究的前沿。自1995年Vieille等[10]成功克隆并表達了木糖異構酶基因后，以木糖作為篩選劑的遺傳轉化已在多種糧食作物上得到深入研究，但在蔬菜上的應用卻十分有限。

Haldrup等[8]將木糖異構酶基因通過農桿菌介導，成功地轉化到馬鈴薯、番茄的愈傷組織中，然后將愈傷組織置于含有木糖的培養基中進行篩選，得到了能在該培養基中正常生長的轉基因植株。應用木糖作為篩選劑的轉化效率大致為18%～32%，明顯高于應用卡那霉素篩選的轉化率（4%～6%）。Haldrup等[11]最終確定以木糖作為篩選劑在番茄上進行遺傳轉化的碳源最佳配方為不含蔗糖，且D-木糖濃度為15 g/L，應用此配比的轉化率可達9%，而用抗性標記選擇的轉化率僅為7%；馬鈴薯最適篩選配比為蔗糖7.5 g/L、木糖3.75 g/L，應用此配比的轉化效率比用卡那霉素作為選擇標記時高9倍，轉基因植株中木糖異構酶活性為非轉基因植株的5 ～25倍[12]。在不同作物中，木糖的篩選濃度有所差別，且轉化率也有不同。

崔麗巍[13]以大腸桿菌xylA作為選擇標記基因，利用木糖作為選擇劑獲得能夠表達帶有GUS報告基因的轉基因黃瓜，同時還構建了pX390-scFv載體，初步建立了農桿菌介導的基于木糖選擇系統的黃瓜轉化體系。最終確定選擇在培養基中加入 15 g/L 的木糖和 15 g/L的蔗糖，能獲得較高的轉化效率。

4?小結與展望

近年來，以糖代謝相關基因作為選擇標記的正向選擇系統得以迅速發展，目前應用較多的是磷酸甘露糖異構酶基因，而木糖異構酶標記基因應用相對較少，但已證明在植物遺傳轉化上是安全、有效的。

目前，筆者已經成功構建基于木糖異構酶標記基因的植物表達載體，并在馬鈴薯上應用D-木糖成功進行了遺傳轉化，建立了一套安全且轉化率高的馬鈴薯轉基因體系。在此工作基礎上，將著力建立辣椒、黃瓜等受基因型限制、轉化效率低的蔬菜作物遺傳轉化體系，提高蔬菜作物遺傳轉化效率，緩解因轉基因食品安全性問題帶來的困境，促進蔬菜基因工程育種工作健康發展。

參考文獻

[1] 王彩芬.植物遺傳轉化中選擇標記基因的研究進展[J].現代農業技術，2009（2）：6-10.

[2] 孫艷，戴紹軍， 魏建華，等.轉基因植物標記基因安全性研究進展[J].現代農業技術，2012（3）：17-20.

[3] 郭新梅，張曉東， 梁榮奇，等.以木糖異構酶基因為篩選標記的玉米遺傳轉化[J].植物生理與分子生物學學報，2007，33（6）：547-552.

[4] 毛萍，蔣彬， 馬欣榮，等.木糖對多年生黑麥草愈傷組織生長的影響[J].草業科學，2011，28（5）：758-762.

[5] 孫磊，張國軍， 閆愛玲，等.木糖異構酶基因xylA的克隆及其表達載體的構建[J].生物技術通報，2011（7）：167-170.

[6] 王燁，顧興芳.無抗性選擇標記轉基因技術在蔬菜作物上的應用[J].中國蔬菜，2011（12）：1-9.

[7] 閻淑滑，周波， 趙霞，等.以木糖異構酶基因xylA為選擇標記的Gateway系統植物表達載體的構建[J].生物技術通訊，2010，21（1）：35-38.

[8] Haldrup A，Petersen S G， Okkels F T. The xylose isomerase gene from themoanaerobac- terium themosulfurogenes allows effective selection of transgenic plant cells using D-xylose as the selection agent[J].Plant Mol Biol，1998， 37：287-296.

[9] 韋正乙.利用木糖選擇系統獲得HAL1轉基因百脈根植株及耐鹽性鑒定[D].長春：東北師范大學，2007.

[10] Vieille C，Hess J M， Kelly R M，et al.xylA coling and sequeneing and biochemical characterization of xylose isomerase from thermotoga neapolitana [J].Appl Environ Microbiol，1995，61（5）：1867-1875.

[11] Haldrup A，Petersen S G， Okkels F T.Positive selection： a plant selection principle based on xylose isomerase，an enzyme used in the food industry[J]. Plant Cell Reports，1998，18：76-81.

第4篇：基因工程載體的種類范文

關鍵詞：生物技術；林木遺傳育種；基因工程

中圖分類號： S961.6 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20151132024

樹木育種是林業發展中一個重要的組成部分，其可以為林業種植提供一大批新型的高質量品種，但是由于受到樹木本身遺傳特性的影響，部分遺傳特性無法通過傳統的手段來進行更改。而生物技術在其中的運用則可以徹底打破傳統研究手段的弊端，從基因學等遺傳角度來對林木育種進行分析和探究，以確遺傳育種的質量，同時其也可以為林木遺傳改良的發展奠定堅實的基礎，所以對于生物技術在遺傳育種中的應用進行研究具有重要的意義。

1 材料與方法

林木遺傳育種實際上就是通過改良和探索林木遺傳的規律和特性來提升林木種子的整體生長質量。本次研究主要借鑒國內外有關林木遺傳育種方面取得的成就來進行分析和研究，以更好的指導我國林木遺傳育種的發展。目前，我國林木種群面臨這嚴峻的種植危機，所以林木遺傳育種的重要性日益提升，其已經逐步成為林學學科中研究的龍頭學科，但是林木遺傳育種必須要切實結合常規育種和現代生物技術，以不斷加快育種的進程，縮短育種周期，以創設出一大批新的品種。另外，本次研究主要采用文獻參考法來借鑒林木遺傳育種所涉及到的各個生物領域，具體主要包括林木基因組、林木遺傳轉化和林木基因工程等3個方面，同時就這些方面的研究內容進行了詳細地分析和闡述。

2 結果

2.1 林木基因組方面

通常而言，生物學中的遺傳標記主要包括分子標記、形態標記、同功酶標記和細胞學標記等幾種標記類型，而分子標記則實際上是以DNA分子本身所具有的多態性為基礎的一種遺傳性標記形式，其可以充分反映生物個體以及群體間所具有的特定DN段。在當前的林木業中所用的分子標記方式主要由SSR（簡單重復序列）、RFLP（限制性片段多態性）和AFLP（擴增片段多態性）等形式，并且已經廣泛應用于基因定位、親緣關系鑒定、克隆以及遺傳育種等領域中，并且已經在基因控制方面取得了優異的成績。

2.2 林木遺傳轉化方面

近些年來，我國在遺傳轉化效率提高方面進行了深入的研究，并且產生出一些新技術，比如超聲波輔助農桿菌介導法（SAAT）、農桿菌介導結合法、低能離子束、負壓與農桿菌介導結合法以及基因槍與農桿菌介導結合法等，這些均有助于提高相應的基因轉化效率，增強農桿菌浸染質量。比如，在2003年時期，Zaragoza等將抗除草劑中的bar基因片段借助SAAT導入到刺槐中，并成功獲得了的轉基因植株。

2.3 林木基因工程方面

針對林木基因工程方面的研究，現在主要包括抗病基因工程、抗蟲基因工程、抗逆基因工程以及木質素改良基因工程等幾個方面。在抗病基因工程方面，我國在抗病毒基因研究方面的起步比較晚，借助的抗病毒基因只有黃瓜花葉、楊樹花葉和洋李痘等病毒外殼蛋白基因。林木抗真菌基因主要包括角質酶基因和幾丁質酶基因等類型，具體基因研究內容主要包括過氧化物酶、黃酮合成酶、抗菌肽以及溶菌酶等基因，并且以抗菌肽基因為主。比如，Scorza R.等將杏（Prunus）導入到洋李痘病毒（PPV）的外殼蛋白中，達到了提高該病毒植株抗性的目的。另外，實驗人員借助農桿菌介導法將毛白楊導入到兔子體內克隆的防御基因中，并達到了抑制多種微生物生長的作用，比如立枯病、農桿菌和枯草桿菌等等微生物。

在抗蟲基因方面。調查研究表明，當前全球范圍中已經有超過60種轉Bt殺蟲基因植物。比如，張冰玉等借助根癌農桿菌介導法在銀線楊基因組中導入抗鞘翅目害蟲基因（Cry3A）而獲取了新型的再生植株；而Southern及PCR點雜交的實驗結果表明，外源基因已經可以被整合到楊樹基因組中，并且經過生物學的研究，轉基因株系BGA-5已經具有毒殺光肩星天牛以及抑制植物生長的效果，并且殺蟲率高達30%，而抑制幼蟲的生長率也達到80%左右。

在抗逆基因工程方面。植物本身的抗寒性主要是由多種基因所共同控制的，單靠幾個基因是無法確保其抗寒特性的。比如，楊川平等以無菌葉片作為轉化受體的主要材料，借助根癌農桿菌介導法來將Bet2A這一外源基因導入到小黑楊的無菌苗葉片中的特定基因中，同時對于已經獲得轉化的11株轉化苗進行了斑點雜交和PCR擴增檢測，并得知外援基因Bet2A已經順利整合入小黑楊基因組中。又如，Wei Tang等在火炬松中借助根癌農桿菌介導法導入葡萄糖醇6-磷酸脫氫酶基因和甘露醇1-磷酸脫氫酶基因這兩種類型的基因，并成功獲得了具有高耐鹽性的轉基因植物品種。

3 討論

在林木基因組方面。雖然傳統的分子標記具有一定的優勢，但是依舊存在著一些不足和缺陷，比如分子標記在各個遺傳背景中的表現穩定性不足等。特別是隨著楊屬植物基因組計劃的實施，該全基因組信息可以為其他類型林木基因組的研究與發展提供重要的參考，同時也可以幫助學生可以從特定的基因組中找尋其對應的功能，從而進一步加快分子育種技術的快速發展。

在林木遺傳方面。林木基因工程開展的重要前提是要先建立一個科學、完善的遺傳轉化體系。但是遺傳轉化工作本身是一項綜合性很強的工作類型，其主要包括：攜帶外源基因載體系統的構建、組培再生系統的建立以及基因轉化系統的構建等。通常而言，林木的遺傳轉化實際上主要包括兩個受體系統，即體胚發生與器官發生。胚狀體再生系統本身具有很強的外援DNA接受能力，并且可以嵌合的轉基因植株體比較少，加之其本身的繁殖率比較高，適合大規模生產，所以其是當前最為理想的基因轉化受體系統。農桿菌是當前林木遺傳轉化的介導，而隨身深入了解Vir基因在實際轉化中的應用，大大提高了農桿菌介導轉化的頻率，同時也有利于提高Vir基因的實際轉化效率。

在林木基因工程方面。林木病害是致使生產力出現降低的一個主要原因，所以在林木中導入抗病基因具有廣泛的應用前景。蟲害是影響林木生長的重要因素，甚至會毀滅一大片的森林。林木抗蟲分子育種研究的基因類型主要包括蛋白酶抑制劑基因（PI）和蘇云金桿菌毒蛋白基因等兩種類型。目前，在病蟲防治方面，我國對于蘇云金芽孢桿菌制劑的應用已經具有數十年的發展和研究史，其所產生的Bt毒蛋白（昆蟲毒素）已經被廣泛應用于抗蟲植物基因的研究中來。通過修飾、改造和表達Bt殺蟲基因蛋白中的基因，可以更好地培育有關的抗蟲轉基因植物；而在當前的林木抗逆基因中，主要包括耐鹽、抗旱和抗凍層基因類型，其中的耐鹽和抗旱基因主要是與肌醇、甘露醇和脯氨酸等滲透壓調節分子所合成的一種基因類型，比如乙醇脫氫酶基因和脯氨酸合成酶基因等；在抗寒、抗凍方面，已經在魚類抗凍基因途徑、糖類基因和超氧物歧化酶等的研究方面取得了很大成果。

隨著生物技術的發展，基因工程等先進的遺傳學知識為林木遺傳育種的發展開辟了一條嶄新的發展途徑。其不僅可以突破傳統育種手段的束縛，從DNA基因角度來對育種遺傳進行研究，也可以大大節省人力、物力、和空間，提高林木遺傳育種的研究質量，并在抗病基因工程、耐鹽堿基因工程和提高光合效率等領域內均取得了突破性進展。相信在不久的過來，生物技術必將會為林木育種發展創造更大的經濟和社會效益。

參考文獻

[1] 沈熙環.林木常規育種與生物技術的應用[J].林業科技開發，2014，20（1）：1-4.

第5篇：基因工程載體的種類范文

關鍵詞：芳香烴類化合物　微生物降解　生物強化　基因工程菌

一、芳香烴類化合物的來源與危害

目前，全球每年大約有百萬噸芳香族化合物被制造出來，這些化合物除廣泛用于生產塑料聚合物、農藥、染料、醫藥和其它日用品當中外，還廣泛應用于冶金、炸藥和化工產品的制造中[1]。這些物質在制造與利用的過程中，其中的有害物質不可避免的泄漏到環境中，導致土壤和水體環境質量下降，危害生態系統安全，從而造成嚴重的環境污染。

眾所周知，芳香烴類化合物是可致癌或有潛在致癌性的物質，由于它毒性強且結構較穩定，所以很難通過降解除去。傳統的處理方法包括物理法和化學法，如活性炭吸附、溶劑萃取、焚燒、深埋等[2]，這些方法不但效率低、成本高而且容易造成二次污染[3],目前為降低環境中芳香烴的含量，世界上采用的最安全有效的方法即微生物技術。

二、常見的降解菌株及其降解機理

芳香烴類化合物主要包括：苯、硝基苯、烷基苯、鹵代苯、苯胺等[4]。主要降解微生物有假單胞菌屬、反硝化菌屬、產甲烷菌屬、節細菌屬、芽孢桿菌屬、無色桿菌屬、棒狀桿菌屬、黃桿菌屬、土壤桿菌屬、黃單胞桿菌屬、微球菌屬、氣桿菌屬、埃希氏桿菌屬等，以及一部分放線菌、真菌、藻類[5]。它們的代謝途徑分為好氧代謝和厭氧代謝。

1.芳香烴的好氧降解

芳香烴的好氧降解較厭氧降解更容易實現，所以目前發現和研究的大部分微生物都是好氧微生物。正常條件下培養的好氧微生物可以產出混合功能的雙氧化酶或氧化酶，這些酶在分子氧的參與下．使苯環羥基化。從而引發芳環的裂解，所以能有效地降解芳香烴化合物[6]。

Claude-henri等在對微生物降解土壤中石油烴的實驗中發現，大部分的芳烴組分發生了降解。微生物降解芳香烴的最初途徑是多種多樣的，但這些反應均具有一致的中間產物。鄰苯二羥基類化合物原兒茶酚和兒茶酚就是大多數微生物代謝芳香化合物的過程中產生的中間產物[7]，同時也是環裂開前共同的先導性中間產物。

2.芳香烴的厭氧降解

厭氧降解是指在缺乏氧氣的外界條件下，一些厭氧微生物、兼性厭氧微生物將有機物作為電子供體，將除氧以外的其他物質作為電子受體，微生物在降解有機物的同時獲取化學能量。厭氧條件一般可分為4種：嚴格的產甲烷環境或發酵，以硫酸鹽為最終電子受體，以硝酸鹽為最終電子受體以及以Fe(Ⅲ)為最終電子受體。

2.1嚴格的產甲烷條件或發酵

“產甲烷條件”是指適合甲烷產生的環境或發酵條件。在產甲烷條件下，最終電子受體——二氧化碳被還原成甲烷，在外界存在電子受體或發酵的條件下，厭氧微生物可以將醇、酸、醛、酚等含氧芳香烴厭氧降解。簡單含氧芳香烴的降解是以還原反應為基礎的，還原反應可將芳香環轉化為帶有含氧取代基的脂環，大部分此類脂環均可以發生水解反應并破裂。

2.2以硝酸鹽作為最終電子受體

硝酸鹽呼吸菌一般是兼性厭氧菌，在氧氣消耗完全時呼吸菌即可利用硝酸鹽。不同的微生物種群對于硝酸鹽的還原作用不同，可將其還原為氨或分子氨。在脫氨實驗過程中，陳余道等發現在3個月的馴化期后，原環境中 14c甲苯的含量為0.25 mg，其中有75％在8天內被全部菌群轉化，生成14C二氧化碳；經過7個月的穩定期后，在相同環境下，8天內間一二甲苯中的80％被菌群轉化，生成 14C二氧化碳，同時硝酸鹽被還原為氨氣[8]。

2.3以硫酸鹽作為最終電子受體

硫酸鹽可以作為硫酸鹽還原菌厭氧代謝過程中的的外來電子受體。這種代謝通常是在硝酸鹽耗盡時發生，硫酸鹽在代謝過程中被還原為硫化氫。以硫酸鹽作為最終電子受體的厭氧降解在很多環境中可被發現，硫酸鹽還原菌能夠降解苯甲酸、羥基苯甲酸和苯己酸等很多芳香烴化和物[8]。

2.4鐵(Ⅲ)作為電子受體

此外，鐵(Ⅲ)也可作為厭氧微生物降解芳香烴過程中，微生物生存需要的電子受體[9]。經研究，若含水層中含有豐富的鐵(Ⅲ)，其中的微生物對于芳香烴類化合物的轉化則較易進行。證明了鐵(Ⅲ)還原與烴降解之間的相關關系。

三、生物強化技術

雖然目前通過實驗研究已發現了很多種可以降解不同種類芳香烴化合物的微生物菌株。但一方面由于外界環境不適合某些菌株的生存，降低了它們的繁殖速度，使有機物難以按預期目標快速降解；另一方面，多數菌株具有較強的專一性，而污染環境中常存在多種芳香烴化合物，單一菌種不能獨立清潔含多種有機混合物的廢水,因此需要通過生物強化技術來解決這一問題。

1.生物強化技術

生物強化技術(Bioaugmentation)是指通過向傳統的生物處理系統中引入具有特定功能的微生物，提高有效微生物的濃度，增強對難降解有機物的降解能力，提高其降解速率，并改善原有生物處理體系對難降解有機物的去除效能。

以姚秀清等運用生物強化技術對煉油廢水中含量較高的幾種芳香烴及其衍生物(甲苯、對二甲苯、乙苯、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并噻唑)進行降解的研究為例[10]。他們分別選育出了可專一高效降解上述5種難降解有機物的菌種，并按一定比例制備成復合菌劑，運用生物強化技術將復合菌投入模擬廢水反應池中，觀測其在反應池中的降解效率，研究生物強化技術的處理效果。

2.復合菌劑的作用

在模擬廢水處理反應池中復合菌劑有較明顯的生物強化作用。復合茵劑的投加可以增加COD的去除效率，減短反應達到平衡狀態的時間，及增強抵抗負荷的程度。此外，不同的菌劑投加量，對系統反應速度加快及應對能力增強的效用也不同，生物強化作用在投加lO％高效菌的時候需要最短的啟動時間。

復合菌劑的應用使系統內優勢菌群的種類發生了變化，進而提高了系統污水處理的效率。但是對于提高系統中高效菌對環境的適應能力、降解活性、及增強菌群競爭能力等問題，仍然有待進一步研究。

四、降解性質粒的研究及基因工程菌的構建

由于系統中高效菌的生存能力低、降解效率差，且存在菌群競爭。因此，可以通過將降解性基因轉入適應性較好、繁殖力強的菌株內，或將可降解不同有機物的多種基因克隆到同一受體菌株內，構建出高效“基因工程菌”[4]，達到徹底降解芳香烴類化合物的目的。

1.降解性質粒的研究

在研究苯及其衍生物的降解性質粒的過程中，人們發現在不同種類的微生物中，存在著一些極為類似的基因，它們控制了降解的關鍵途徑。如在降解苯乙烯的過程中，產生的TOL質粒pWWO與PST質粒是十分相似的。可分解代謝甲苯的好氧質粒TOL質粒在假惡臭單胞菌MT一2菌株中發現[4]。目前，對于TOL質粒的形狀、基因結構及調控機理等已研究透徹，成為了發現其他降解性質粒的良好開端。

近年來，我國在研究降解質粒方面取得了一定的成果，主要包括對降解性質粒的觀察、檢測、質粒提取、及確定酶所在位點等[11]，但關于目的基因調控、基因的定位等方面還有待于進一步研究。另外，很少有報道提到了降解性質粒對于蒽醌類化合物的降解研究。

2.基因工程菌的構建

基因工程菌的基本構建過程為：從染色體或降解性質粒中選取起關鍵作用的基因片段，將其接種在適當的載體上，一同移入受體菌中，此時受體菌便有了新的降解功能。將所選取的基因片段轉入受體菌的主要方法有：接合型質粒轉移、整合型質粒轉移和重組質粒轉化。

2.1接合型質粒轉移(injugetive plasmid transfer)

接合型質粒轉移指通過供體細胞與受體細胞的緊密接觸，使質粒轉入受體細胞當中，使基因通過細菌間的有效接觸而發生的橫向轉移的過程[12]。Chatteriee DK 等將惡臭假單胞菌的TOL質粒pWWO接合到某一細菌的馴化菌株中，該細菌能將TNT苯環上的3個硝基氧化脫除，并利用其作為氮源來滿足生存需要，獲得的菌株既可以氧化消除硝基又可以降解甲苯，將TNT作為生存所需的碳、氮源，從而使其礦化。

2.2整合型質粒轉移(integrative plasmid transfer)

將降解目的所需的基因連接到可整合基因的質粒(含F因子)上，之后一同移入受體菌中，使該基因片段永久性留存于受體菌的染色體上，使基因所表現的降解性能可以穩定遺傳。

在用于耕作土壤中，Ka等研究發現了新的2,4-D-降解菌株，并從中分離出了可自我遺傳的降解性質粒-，4-D。其中質粒pKA2在菌株2811P上。分離出最初馴化的2811C菌株，觀測到所有pKA2質粒均已整合到受體菌染色體上，沒有破壞2,4-D的性狀。

2.3重組質粒的轉化(recombinant plasmid transfer)

重組質粒是指向一個質粒中同時轉入多個有不同降解能力的基因片段，使受體菌可同時降解多種芳香烴，擴大了菌種的可降解范圍、增強了菌種的降解能力。

五、存在的問題及展望

綜上所述，在實驗研究中，復合菌劑的使用，以及基因工程菌的構建，均可大大提高芳香烴類化合物的降解效率。但是當將復合菌劑應用于現實環境中芳香烴類化合物的降解時，就會出現降解系統中高效菌的降解活性下降、存活能力差及菌群間出現競爭等問題。此外，關于基因工程菌方面，國內單純研究了各種降解性質粒，國外已構建出一些基因工程菌，但由于其安全性問題，目前尚未投入工業化生產。

因此，如何解決以上問題，使復合菌劑以及基因工程菌能真正用于解決環境問題，快速、徹底的降解對環境造成危害的芳香烴類化合物，仍有待進一步的研究。

參考文獻

[1]張晶.任慶.朱煥山.芳香族化合物生物降解研究現狀與展望[J]遼寧城鄉環境科技.2004,24(1).

[2]陳余道.朱義年.蔣亞萍.汽油污染含水層中芳香烴的自然去除與生物降解特征[J]地球化學.2004,33（5）.

[3]鄧琦.常萍.周圍.程國軍.芳香烴化合物降解菌CP5的降解特性及降解基因[J].華中農業大學學報.2010,29(2):185-188.

[4]杜翠紅.周集體.王競.嚴濱.宋智勇.樸香花.難降解芳香烴生物降解及基因工程菌研究進展[J].環境科學與技術.2005,28（1）.

[5] 楊永華．華曉梅.陳素玲．等．芳香族化合物生物降解代謝及其分子遺傳研究[J]．環境科學進展.1995，3(6)：3l-43.

[6] 金若菲．王競，張勁松．等．蒽醌染料中間體的降解脫色研究[J]．環境科學研究，1999，12(6)：32-35．

[7]盤志剮．張彤等．污染物生物降解[M]上海：華東理工大學出版社，1997．

[8]陳余道,朱義年，蔣亞萍，朱銀紅，程亞平,黃宗萬.汽油污染含水層中芳香烴的自然去除與生物降解特征[J].地球化學.2004,33（5）.

[9]牟伯中.蘇榮國.王修林.倪方天.周嘉璽.微生物對芳香烴的降解作用[J].2000,15(4).

[10]姚秀清.徐軍祥.張全.復合菌劑生物強化SBR降解芳香烴及其衍生物的研究[J].化學與生物工程.2007,24(8).

第6篇：基因工程載體的種類范文

【關 鍵 詞】 重慶；高考；試題；復習；教學

高考試題體現了知識為載體，以能力立意為指導思想，充分考查學生的理解能力、實驗與探究能力、獲取信息能力、綜合運用能力，對高三教學具有導向性和指導性。因此，研究高考試題，能使我們明確高考的方向和重點，是搞好高三復習教學的重要環節。

一、必修和選修所考主要內容

分析2006—2011年高考理科綜合（重慶卷）生物試題中必修所考的章節及分值，可看出前5年（2006—2010年）每年都考的必修本內容主要是新陳代謝、遺傳、生命活動調節、生態、細胞。總的來看，新陳代謝、遺傳、生命活動調節是每年必考的內容，可占約10—20分；生態的內容2006—2010年都有考到，06—09年都出的是選擇題，2010年出了一個大題占12分。細胞的內容2009—2011年都考了，一般出的是選擇題。生命的物質基礎2006—2009年也都考了，一般也是出的選擇題。

分析2006—2011年高考理科綜合（重慶卷）生物試題中選修所考的章節及分值，可看出選修本主要考查的內容是一、三、五章的調節和免疫、基因工程、微生物與發酵工程，分值約占15—18分。因此，選修本復習的重點應放在一、三、五章。

二、選擇題和非選擇題所考內容

從2006－2011年（重慶卷）高考生物試題來看，5道選擇題考點相對穩定，一般是出在生態、代謝、生命活動調節（或細胞的結構功能）、免疫調節、微生物等知識；非選擇題（二道大題）考主干知識，一般是出在代謝、生命活動調節、遺傳、基因工程及細胞工程等知識，其中有一小題必然是考查實驗內容的，非選擇題考多個知識點，綜合性較強。

三、重點知識考查內容

新陳代謝部分考查的重點是光合作用（過程、場所、光能在葉綠體中的轉換、影響光合作用因素）、酶（概念、特性、性質、溫度對酶活性的影響）、三大營養物質代謝（糖、蛋白質、脂類）、細胞呼吸、植物細胞的吸水和失水、根對礦質元素的吸收、教材中的還原糖鑒定和蛋白質鑒定的實驗、葉綠體中色素提取實驗。

生命活動調節部分考查的重點是植物激素調節（生長素、秋水仙素）、反射弧（脊蛙反射實驗）、反射弧的結構及其功能、動物激素調節和神經調節、甲狀腺激素分泌的調節及生理功能。

遺傳部分考查的重點是自由組合定律、分離定律、推斷寫出基因型與表現型及比例、概率計算、染色體變異、多倍體育種、性別決定、伴性遺傳、基因突變、基因重組、細胞質遺傳。

基因工程及細胞工程部分的考點是基因的結構、基因工程操作步驟、運載體具備的條件、植物細胞的全能性、愈傷組織特點、動物克隆技術（核移植）等，這部分內容多與遺傳知識結合起來出題。

微生物部分考查的重點是微生物的培養、微生物的類群、微生物的營養、微生物的生長、微生物代謝與繁殖、微生物滅菌方法、菌落的定義、培養基的類型等。

生態部分考查的重點是生態系統的物質循環和能量流動、生態系統的功能、生態系統營養結構、種群、群落、食物鏈食物網、種群密度與數量、種群的出生率與死亡率、群落的結構、種間關系等。

免疫調節重點考查的是特異性免疫、細胞免疫、體液免疫、抗原和抗體、血糖平衡調節等。

四、高三復習教學建議

（一）扎實抓好基礎，突出主干知識

能力是以知識為載體的，要使學生提高學科內的綜合能力，就必須夯實基礎知識。因此在教學中，教師要進一步幫助學生查漏補缺，指導學生將基本知識進行整合，構建完整的學科知識網絡；要以專題復習為主，引導學生理解每個知識點的內涵、各個知識點的內在聯系、每章節知識的聯系，從而夯實基礎。

高考生物試題中，教材重點章節內容占的分值總是較大，尤其是新陳代謝、遺傳、調節、生態等內容，一直是理科綜合測試的重點。所以，在抓好基礎知識教學的同時，一定要突出主干知識的教學，它是復習教學的重中之重。

（二）加強實驗教學，培養實驗能力

生物實驗是每年高考必考的內容，出在非選擇題的一個小題，它利于考查學生的創新能力和實踐能力。因此在復習中，應圍繞明確實驗目的、理解實驗原理、設計實驗步驟、分析實驗數據、得出實驗結論、分析解釋實驗現象和結果、實驗材料的選用、實驗試劑的使用及顏色變化、實驗結果的鑒定等內容進行復習，讓學生掌握一些科學實驗的基本方法；學會如何做對照實驗，讓學生學會用簡短的文字準確地表達實驗過程和實驗結論；指導學生學會解各種類型實驗題的思路和方法。還要重視對教材實驗的復習和課本中經典實驗的復習，以及注意與教材中的實驗或內容相關的“拓展實驗”的復習。

（三）加強綜合訓練，學會解題方法

在基礎復習和專題復習的基礎上，后階段的綜合復習要注意加大學科內綜合訓練的力度。教師應廣泛收集、閱讀一些資料，精心篩選學科內的綜合試題和典型例題，給學生在課堂上練習，并及時反饋學生做題的情況，然后，教師針對學生的知識漏洞及時進行評講和補救，讓學生知道解題思路，學會解題方法、正確審題和規范答題。在進行綜合訓練的同時，還要注意培養學生用生物學術語來準確、規范地進行表達敘述的能力。

（四）注重選修知識，有機聯系必修

高考選修本的內容約占15分。在選修本的復習教學中，要特別注意與必修教材有關聯的內容，這些內容往往是學科內知識綜合的切入點。如基因工程與遺傳，細胞工程與遺傳，水和無機鹽、血糖、體溫調節與新陳代謝，微生物培養與生物代謝類型，光合作用過程中的電子傳遞和光合作用過程的聯系。

高三生物復習教學是一個細致復雜的工作，需要教師的智慧和勤奮，需要教師充分備課，為學生準備復習的“材料”，課堂上要充分發揮教師的主導作用和學生的主體作用，才能取得較好的復習效果。

【參考文獻】

第7篇：基因工程載體的種類范文

關鍵詞：小鼠；MCK基因；啟動子；序列分析

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）02-0005-06

在轉基因動物研究中，外源基因都需要在某種組織異性表達，因此，組織特異性啟動子對于外源基因組織特異性表達具有重要作用。另外，組織特異性啟動子是研究細胞分化、基因工程以及再生醫學應用中的重要工具。據報道，由肌肉特異性調控元件構成的啟動子能夠指導載體進行肌肉特異性表達，在非肌肉細胞中表達很低[1]，這些調控元件包括肌酸激酶（Creatine Kinase， CK）調控元件[2]、骨骼肌肌動蛋白調控元件[3]、肌球蛋白重鏈調控元件[4]和其他肌肉基因的調控元件。高等脊椎動物肌酸激酶存在胞質型和線粒體型兩大類，其中胞質型包括肌肉型肌酸激酶（Muscle Creatine Kinase， MCK）和腦型肌酸激酶（Brain Creatine Kinase， BCK）兩種形式，而在線粒體中存在CKmt1和CKmt2兩種類型的肌酸激酶[5]。肌肉肌酸激酶基因主要存在于各種肌肉細胞中，骨骼肌和心肌中都含有肌酸激酶，尤其骨骼肌含量最為豐富，占全身總量的96%，在收縮肌肉中被轉錄激活，在成年心肌和骨骼肌中高度表達[6]。

第8篇：基因工程載體的種類范文

80年代后期,人們通過感染植物的方式將發根農桿質粒上的一段轉移去氧核糖核酸轉移到高等植物細胞的基因組中,誘導出毛狀根,建立起毛狀根培養系統[6]。黃遵錫等[7]建立了紅豆杉毛狀根培養體系，發現在紅豆杉的毛狀根中紫杉醇的含量是其愈傷組織中的近8倍。常振戰等[8]報道，對無刺曼陀羅毛狀根繼代培養5年以上仍保持合成托品烷生物堿的穩定性。冠癭組織來源于冠癭瘤，冠癭瘤的產生與根癌農桿菌有關。它和發根農桿菌是同屬的另一種土壤桿菌，也是植物的一種病原菌；根癌農桿菌含有Ti-質粒，轉化后的表現性是冠癭瘤。用冠癭瘤組織作為培養系統也具有生長素自養，增殖速度快等特點，也可以做細胞懸浮培養。毛狀根和冠瘤組織培養技術為生產藥用活性成分提供了一條有效途徑。傳統藥材1/3是植物的根部，因此該項技術對其生產尤為重要。目前已在長春花、煙草、紫草、人參、曼陀羅、顛茄、丹參、黃芪、甘草和青蒿等40多種植物中建立了毛狀根培養系統。經根癌農桿菌感染形成畸形芽，也已在薄荷、顛茄等植物上取得成功。傳統中草藥的脫毒研究由于病毒可以傳到植物的子代，藥用植物的種子帶病毒是傳統栽培技術難以解決的問題。如果采用細胞工程技術，在無菌條件下對植物的分生組織進行離體培養可以解決這一問題。這里利用的是植物內病毒分布不均勻的原理，在植物病毒含量最少的生長錐中取樣，再培育出小苗，以此改善由于病毒而引起的中藥品質退化的問題。已有研究表明,太子參采用莖尖脫毒后的種苗產量為1498.4千克/公頃，比種根苗的產量736.1千克/公頃提高103.6%，具有非常明顯的增產優勢[9]。瞿宏杰等研究了麥冬脫毒前后的產量變化：脫毒苗分蘗快，分蘗數明顯增多，所以塊根數目增加，盆栽結果發現，單株產量脫毒苗與未脫毒苗分別為4.87g、3.36g，產量增加44.9%[10]。目前，我國科學家已經在懷地黃、甘薯、丹參、柑橘、枸杞、姜、蒜等多種藥用植物的脫毒中獲得成功。

發酵工程在中草藥中的應用

發酵工程又稱微生物工程，是利用現代工程技術手段，利用微生物的特殊功能產生有用的物質，或直接將微生物應用于工業生產的技術。中草藥生物技術中的發酵工程，主要是針對藥用菌類植物的發酵法生產有效成分而言，或者利用微生物培養的原理和技術大規模培養藥用植物細胞，從而獲得其中的藥用成分等。利用發酵技術生產藥用活性成分，還可以使藥品生產規范化，藥源質量穩定，有利于這些藥物的產品進入國際市場。傳統的靈芝栽培方法周期長，從中提取靈芝多糖遠不能滿足市場需求，且每批產品的多糖組分和含量相差較大，而通過液體深層發酵技術生產靈芝多糖具有生產周期短、多糖組分和含量相對穩定、主要組分和野生靈芝基本一致等特點，成為獲取靈芝多糖的最有效方法[11]。目前，我國冬蟲夏草、靈芝、云芝、猴頭等藥用真菌的發酵產品已投入市場。

酶工程在中草藥中的應用

酶工程是利用酶的催化作用進行物質轉化的技術，是將生物體內具有特定催化作用的酶類或細胞、細胞器分離出來，在體外借助工業手段和生物反應器進行催化反應來生產某種產品的工程技術。它既包括利用人工酶催化方法，對藥用植物中的藥效成分進行修飾，以提高藥物品質；也包括利用人工酶催化方法改進中草藥制劑過程，如降解淀粉、蛋白、果膠等雜質，分解植物組織，提高藥液制劑的澄清度，降低提取難度等。如金東史等人利用酶轉化方法將人參中的主要皂苷成分轉化成含量只有十萬分之幾的人參皂苷Rh2，并達到了月產30kg的生產規模[12~13]。利用自制復合酶對、三七總皂苷、三七莖葉總皂苷等系列中藥有效部位進行了酶法轉化研究[14]，通過HPLC和LC-MS分析發現可以明顯改變一些皂苷成分的結構,并降低相應化合物的極性,增加了有效部位中脂溶性成分含量；同時，利用這些復合酶直接酶法轉化處理人參、三七、三七莖葉等藥材,結果表明復合物酶亦能高效地轉化藥材中部分皂苷成分為低極性皂苷。

基因工程在中草藥中的應用

基因工程是首先克隆或合成目的基因，再按照預先的設計，將目的基因和載體重組在一起，以一定的方式導入生物體內，讓受體生物的遺傳性狀發生預期的改變，或者讓受體生物產生目的基因編碼的蛋白質等。有關代謝途徑的基因工程研究植物次生代謝產物有重要的經濟價值，就藥物而言，有很多臨床應用的藥物都是植物的次生代謝產物。然而植物次生代謝產物種類繁多，生物合成途徑也千差萬別，只有在了解目標植物特定次生代謝產物的基礎上，才能有選擇的進行有效的基因操作。為此，次生代謝產物以及次生代謝產物途徑的研究，一直是科研工作者感興趣的課題之一，尤其是對次生代謝物的調節與調控。近年研究主要集中于了解與次生代謝相關的酶類及有關基因。中國科學院植物研究所葉和春研究員課題組已克隆出青蒿素生物合成途徑中4個關鍵酶基因，構建了不同啟動子下的Cad和FPP基因已整合到青蒿發狀根和愈傷組織的基因組中，并在轉錄水平上已有表達，轉基因材料青蒿素的含量有顯著提高，使青蒿素的生物合成達到了分子調控的水平[15]。又如名貴中藥石斛藥源緊張的解決，就是利用毒性基因的誘導表達[16]。此外，利用基因工程技術人工定向改變藥用植物的遺傳性狀，可培養出一些抗病毒、抗蟲害、抗除草劑的新型中藥，能減少農藥的使用，杜絕農藥和重金屬的污染，從而保證中藥的安全化，促進中藥的出口。中國中醫科學院和佳木斯大學對丹參金屬硫蛋白基因進行了較為詳細的研究,成功克隆了丹參金屬硫蛋白MT22基因,并且研究了銅離子和鋅離子誘導丹參毛狀根中MT基因表達的情況,證實了MT基因在丹參對酮、鋅元素的吸收富集方面發揮著重要的作用。有關轉基因植物反應器的研究利用轉基因植物作為生物反應器表達重組蛋白等生產外源基因編碼的產物是一個很有吸引力的廉價生產系統，它有可能代替成本較高的傳統發酵生產系統。在對丹參的轉基因研究中,陳海敏等[19]將來自葡萄的白藜蘆醇(resveratrol,Res)合酶基因(RS)導入到丹參中,經PCR和PCR2Southern雜交檢測,確定RS基因已整合到部分轉基因丹參基因組中。近年來，作為生物反應器的轉基因植物逐漸增多，研究較為成功的植物主要有煙草、馬鈴薯、番茄、玉米、油菜、大豆、番木瓜、豇豆、菠菜等。藥用植物抗性基因的研究利用分子生物學研究方法和手段，可以定向改變藥用植物的遺傳性狀，培育出具有抗蟲、抗病、抗逆、抗除草劑等藥用植物新品種。

第9篇：基因工程載體的種類范文

關鍵詞：產氣莢膜梭菌；β1毒素；克隆表達

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2016）09-0007-02

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）在自然界中廣泛分布，是人和動物腸道內的一種正常菌，能產生a、β、ε、ι四種主要毒素，根據產生這四種毒素種類的不同，可將產氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E五種類型[1]。該菌在家禽中主要是能引起壞死性腸炎，雞源產氣莢膜梭菌主要是A型，但也有C型，C型產氣莢膜梭菌主要產生a和β兩種毒素。其中β毒素具有細胞毒性和致死性的特點，是重要的致病因子[2]。課題組在前期進行了雞源產氣莢膜梭菌a毒素的克隆表達及免疫原性研究[3]，本研究旨在進一步對β毒素進行克隆表達，為其診斷試劑和亞單位疫苗的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 C型產氣莢膜梭菌、受體菌大腸桿菌DH5a和BL21（DE3）和pGEX-KG載體由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所保存。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內切酶BamH I和Xho I、PCR試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；RNaseA、Taq DNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；細菌DNA提取試劑盒購自OMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參照NCBI中產氣莢膜梭菌β1毒素全基因組序列，設計1對β1毒素基因引物，上游引物CPb01： 5′-ACGGGATCCTTAGTTATAGTTAGTTCACTTT-3′，下游引物CPb02：5′-ACGCTCGAGCTAAATAGCTGTTACTTTATG-3′，目的片段大小為1 008 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物和下游引物分別含有BamH I和Xho I酶切位點。

1.2.2 全基因組的提取 將產氣莢膜梭菌在厭氣肉肝湯中于37 ℃厭氧培養過夜離心后，將沉淀菌細胞重懸于含2 mg/mL溶菌酶的TE溶液中，混勻后30 ℃水浴10 min。按照OMEGE bacterial DNA Kit說明書進行全基因組的提取。

1.2.3 PCR擴增 50 μL PCR反應體系為：10×Buffer緩沖液5.0 μL，MgCL2（25 mmol/L）4.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL，模板5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL和Taq DNA聚合酶（25 U）1.0 μL，加滅菌雙蒸水補足至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.2.4 PCR產物的回收、連接轉化及鑒定 PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收后，以DNA膠回收試劑盒回收PCR產物，按說明書操作。將回收純化的目的產物與pGEX-KG載體雙酶切后，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，以含有氨芐西林（Amp）抗性平板進行篩選培養，挑取白色菌落于含Ampr的LB液體培養基上培養過夜，以SDS堿裂解法提取重組質粒，經PCR鑒定及BamH I和Xho I雙酶切分析篩選陽性克隆。

1.2.5 陽性質粒的誘導表達及表達產物的SDS-PAGE分析 將構建的陽性質粒轉入受體菌BL21（DE3）經37 ℃加IPTG誘導后，按文獻[4]報道的方法收集菌體變性處理后，進行SDS-PAGE電泳分析。

2 結果與分析

2.1 PCR鑒定結果

采用設計的特異性引物進行β1毒素基因的PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果表明，以產氣莢膜梭菌為模板擴增出約1 000 bp的特異性條帶，與預期大小相符（圖1）。

2.2 重組質粒的雙酶切鑒定

將質粒經PCR鑒定后用限制性內切酶BamH I和Xho I進行酶切鑒定，結果見圖2。由圖2可見，經雙酶切后可獲得大小約為5 000和1 000 bp的2條DNA條帶，即pGEX-KG載體和目的基因條帶，初步表明成功構建產氣莢膜梭菌β1毒素克隆表達質粒。

2.3 β1毒素基因表達產物SDS-PAGE分析

將BL21（DE3）菌株作為表達的宿主菌，經轉化挑取單個菌落培養誘導后，菌體經超聲波處理，提取包涵體，上清經80%飽和硫酸銨沉淀后得到濃縮，沉淀經透析后，用SDS-PAGE分析（圖3），在相對分子質量約為56 ku處出現特異性蛋白條帶，結果表明β1毒素可在宿主菌種得以表達，并且β1毒素蛋白多以包涵體的形式存在表達。

3 討論

產氣莢膜梭菌能產生多種具有致病性的外毒素，其中β毒素不僅能引起家禽壞死性腸炎及仔豬腸毒血癥，也能引起嬰幼兒的壞死性腸炎[5]，危害極其嚴重。本研究利用PCR技術，設計特異性引物成功地從C型產氣莢膜梭菌中擴增出目的片段β1，并構建了成功表達β1毒素的重組菌株，表達的蛋白以包涵體形式存在，純度高。β1毒素的表達為產氣莢膜梭菌的臨床診斷和基因工程疫苗提供了前提。

參考文獻：

[1] SPARK S G， CARMAN R J， SARKER M R，et al. Genotyping of enterotoxigenic Clostridium perfringens fecal isolates associated with antibiotic-associated diarrhea and food poisoning in North America[J]. J Clin Microbiol， 2001， 39（3）：883-888；

[2] TIMBERMONT L， LANEKRIET A， PASMANS F，et.al. Intra-species growth- inhibition by Clostridium perfringens is a possible virulence trait in necrotic enteritis in broilers[J]. Veterinary Microbiology， 2009（12）：l-4.

[3] 張蓉蓉，艾地云，張騰飛，等. 雞源產氣莢膜梭菌a毒素基因克隆表達及免疫原性的初步研究[J].湖北農業科學，2015，54（20）：5152-5154.