微生物的純培養步驟精選(九篇)

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第1篇：微生物的純培養步驟范文

作為全球食品微生物鑒定市場的領導者，法國生物梅里埃可以提供從手工鑒定條到全自動化微生物鑒定系統的完整解決方案，本文在此做簡單介紹。

1、API系統細菌鑒定國際金標準

API系統原理是根據微生物生理生化特征鑒定的結果，進行的數值分類鑒定，是國際細菌鑒定的金標準，幾乎所有的微生物教科書都對該技術有所介紹。

自1970年該微生物鑒定系統問世以來，共有超過1500篇科技文獻對微生物鑒定系統進行研究，其中有600多篇針對生物梅里埃API-20E進行了研究。

API系統是手工操作系統，進行微生物鑒定時要先獲得待鑒定菌株的純菌落培養，隨后經過調制適合濁度的菌懸液，將菌液手工接種入試劑條，部分孔滴加石蠟油封閉后送培養箱進行培養，培養后按照說明書，向部分孔滴加附加試劑。通過定向實驗選擇合適的試劑條是用好該系統的前提。反應完成后進行肉眼判讀，記錄結果并登入apiweb軟件獲得結果。以上步驟均由手工完成。

API方法也是評估其他鑒定產品效果的參考方法。目前API鑒定范圍廣泛，具有15個鑒定系列，菌庫中記錄了生理生化特征的微生物超過600種，新的試劑條和數據庫還在不斷擴充。

2、新一代ATB自動化微生物鑒定系統

新一代ATB自動化微生物鑒定系統是在API手工操作系統的基礎上，由生物梅里埃專為中國和印度市場開發的一套自動化的微生物鑒定系統，這個系統可以兼容API試劑條。

新一代ATB自動化微生物鑒定系統由連續加樣器、主機、電腦(內裝ATB New軟件)、比濁儀、打印機組成。同API相比，該系統在實驗結果判讀、數據庫查詢及結果打印等步驟實現了自動化、標準化操作，判讀采用比色和比濁兩種閱讀方法，避免了肉眼判讀帶來的誤差，提高了鑒定的準確性。

新一代ATB自動化微生物鑒定系統還具備藥敏功能及快速鑒定功能，有儲存超過600種菌生理生化特征的菌庫，目前已經在中小型微生物實驗室得到廣泛應用。

3、VITEK2COMPACT全自動微生物生化鑒定系統

生物梅里埃全自動微生物鑒定解決方案來自于美國的航天科技。早在上世紀60年代，美國航空航天巨頭麥道公司受美國太空總署NASA委托開發一種能夠探索太空未知細菌的科研系統，由于當時計算機技術剛剛起步，最終研究出來的系統有一整幢樓房那樣大。后來隨著空間戰略改變，麥道公司將該系統轉為民用，被生物梅里埃所收購。

收購后，生物梅里埃依據其在細菌鑒定方面的明顯優勢，不僅可以提供全球金標準的細菌鑒定系統API，而且還在生物梅里埃獨有的菌庫(數百株標準菌株)及5000余篇文獻的基礎上，將傳統的生理生化反應技術和卡片、計算機技術相結合，推出革命性的VITEK產品。隨著計算機技術發展及小型化的趨勢，該系統正在逐步得到完善和發展。

最近，生物梅里埃又推出了新型產品――VITEK2 COMPACT。VITEK2 COMPACT可以進行全自動的細菌鑒定，具有方法經典、操作簡便、自動化程度高、結果準確穩定以及權威機構認可程度高等特點。如2005年四川爆發豬鏈球菌感染時，梅里埃的API是最早用來進行鑒定的產品；在2010年7月底內蒙古赤峰自來水被沙門氏菌污染事件中，生物梅里埃的VlTEK也在第一時間用于鑒定。

VlTEK2 COMPACT系統真正實現了從樣本接種到孵育培養，到結果判讀，到數據庫查詢，到最終結果打印過程的完全自動化，鑒定過程所有操作自動化，標準化完成，最大限度的避免人為操作帶來的結果不確定性，是目前市場上自動化程度最高的鑒定系統。

該系統還具有超強的鑒定性能，可快速鑒定超過700種細菌，每種鑒定卡片鑒定準確率均超過95％，平均鑒定時間5小時左右，最短2小時可獲得鑒定結果。目前該系統在我國大中型食品微生物實驗室得到廣泛的應用。

4、微生物鑒定的延伸－基因指紋圖譜系統

第2篇：微生物的純培養步驟范文

【關鍵詞】微生物絮凝劑；活性污泥；印染廢水；絮凝率；高嶺土

1.緒論

1.1 微生物絮凝劑的研究背景

目前，各種絮凝劑廣泛應用于給水、工業廢水、城市污水及污泥脫水、發酵工業后處理、食品工業等領域[1]。絮凝劑主要有無機絮凝劑、人工合成有機高分子絮凝劑和天然高分子絮凝劑三大類[2]，無機絮凝劑主要是鐵鹽和鋁鹽，在使用過程中受pH變化影響較大、生成的絮體易碎、耗量較大、處理后的水中仍含有較高濃度的金屬離子，同時產生大量的含金屬污泥，其處理處置難度大，且可能造成二次污染。通常鐵鹽還有一定腐蝕性，鋁鹽有毒性，已有研究表明鋁鹽能引起老年性癡呆病，對人類健康和生態環境會產生不利影響。鐵鹽會造成處理水中帶顏色，高濃度的鐵也會對人類健康和生態環境產生不利影響。合成高分子絮凝劑如聚丙烯酞胺等具有生產成本低、用量少、絮凝速度快、受共存鹽類、PH值及溫度影響小、生成污泥量少并且容易處理等優點，但這類高聚物的殘余單體具有”三致”效應（致畸、致癌、致突變），限制了應用。所以研究開發新型的高效、無毒、無二次污染、經濟適用的絮凝劑十分必要。

2.實驗部分

2.1試劑和藥品

葡萄糖，脲，酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，硫酸銨，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，氯化鈉，硫酸鎂，瓊脂，重鉻酸鉀，濃硫酸，硫酸亞鐵銨，硫酸銀，硫酸汞，試亞鐵靈，酸性大紅3R，9%0無菌生理鹽水（自配）無菌生理鹽水的制備。

用電子天平精確稱取NaCl 9g，溶于1000ml蒸餾水中，在1000ml的容量瓶中定容搖均后分裝于4個250ml錐形瓶中，加上棉塞，用牛皮紙包住棉塞和瓶口，放入蒸汽滅菌器中，在121℃下，滅菌20min后，即得9%0的無菌生理鹽水，放入冰箱于4℃下保存備用。

2.2實驗方法

篩選方法的模型為：樣品及其預處理一增殖培養一選擇性培養一選擇性培養一選擇性培養一選擇性平板培養（劃線或涂布）一挑選菌落（營養瓊脂平板或斜面）一初篩一單胞分離一復篩一產微生物絮凝劑菌種

2.2.1菌種的富集和馴化

本次實驗，污泥中的菌種共進行三次富集。取一些江紡取來的污泥，放入燒杯中，用5ml移液管移取5ml污泥，移入放有50ml牛肉膏蛋白胨液體培養基的150ml錐形瓶中，用10ml移液管移取10ml污泥，移入放有50ml酵母膏液體培養基的150ml錐形瓶中，將上述兩個錐形瓶，塞上棉塞，包上牛皮紙，貼上標簽，寫上污泥來源，培養基名和日期，放入振蕩培養箱于30℃，160rpm條件下培養2d，進行第一次富集；2d后，進行第二次富集，即用5ml移液管各移取前一次培養的5ml菌液，移入放有50ml兩種液體培養基的150ml錐形瓶中，塞上棉塞，包上牛皮紙，貼上標簽，寫上污泥來源，培養基名和日期，放入振蕩培養箱于30℃，160rpm條件下培養2d；第三次富集同上。

2.2.2菌株的分離

（I） 活性污泥稀釋液的制備：取10 ml活性污泥，放入盛有90ml無菌水 并 帶 有 玻 璃珠的三角燒瓶中，振搖約30分鐘，使活性污泥與水 充 分 混 合 ，將菌分散均勻。用一支lml無菌吸管從中吸取Im l污 泥 懸 液 注入盛有9m）無菌試管中，吹吸三次，使充分混勻。 然 后 再 用 一支Iml無菌吸管從此試管中吸取1m l注入另一盛有 9 m l無 菌 水的試管中，以此類推制成10-1，1 0-2，10-3，10-4，10-5 ， 10-6 ， 10-7 ，10-8，10-9各種稀釋度的污泥液。

（2） 接種：將酵母膏液體培養基、牛肉膏蛋白胨液體培養基、印染廢水液體培養基的三個平板底面分別用記號筆寫上10-7 ，10-8，10-9三種稀釋度，然后用三支Iml 無菌吸管分 別 由 10-7 ，10-8，10-9三管污泥稀釋液中各吸取0.2ml對號放入 已 寫 好 稀 釋度的平板中，用無菌玻璃涂棒在培養基表面輕輕地涂布均勻 。

（3） 培養：將接種好的牛肉膏蛋白胨固體平板和酵母膏固體平板放入生物培養箱中恒溫培養24小時。

（4） 劃線：在培養好的菌株中挑取若干個菌落進行劃線分離。

（5） 挑菌：將培養后長出的單個菌落分別挑取接種到上述四種培養基的斜面上 ， 分別置于生物培養箱中恒溫培養，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單純，若有其他雜菌混雜，就應該再一次進行分離、純化，直到獲得純培養。

3.結果和討論

依據稀釋平板劃線分離法共分離出7株菌種，其中四株是從酵母膏培養基中分離出的，其形態都是小圓狀，編號為1，2，3，4。另外三株是從牛肉膏蛋白胨培養基中分離出來的，其形態分別是小圓、大圓、梭狀，編號為5，6，7。

3.1產絮凝劑的菌種篩選和鑒定

3.1.1菌種的篩選

將分離出的菌株1，2，3，4，5，6，7接種到加了印染廢水的酵母膏培養基中，并相應編好號。在溫度為30度，搖速為160r/min的搖床中培養48小時。

將各菌株經搖瓶培養后，取其培養液加人5 g/L高嶺土懸浮液中，同時以不加培養液的高嶺土懸浮液進行對照，觀察現象，以絮凝出現時間和程度作為判斷絮凝活性的高低進行初篩。培養條件為：250 mL三角瓶，裝量50 mL，轉速1 60 r/rain，溫度30 C 平板及斜面在30 C培養箱中培養。初篩獲得的有效菌株經發酵培養后，將培養液在3000 r/min下離心30 mln，測定其上清液的絮凝話性，進行復篩。絮凝話性測定方法為：100 mL量筒加人0.5 g高嶺土，5 mL10g/l的CaC12和2 mL發酵液.然后加水至100mL，調整pH至7-8，搖勻后靜置3min，同時以不加發酵液的高嶺土懸浮液為對照，用721型分光光度計在550 nm處測定其上清液的光密度。通過絮凝率來表示絮凝活性，公式如下 ： （ A - B） / A ×100 %

A-對照上清液的光密度值；B一樣品上清液的光密度值，篩選結果如下表1：

表1 各樣品的光密度值

由上表1可看出7株菌種都具有絮凝活性，選取1，2，5，7這四株具有較

好活性的菌株接種到發酵液中作下一步培養進行復篩。培養48小時后，重復上述步驟取其發酵液進行絮凝活性測定。篩選結果如下表2：

表2 篩選出的樣品光密度值

由表2可看出絮凝活性最高的為第7株菌株，其絮凝率為71.2%，形態為大圓狀。

3.1.2 廢水絮凝實驗

用廢水代替上述高嶺土懸浮液重復上述步驟。經過目測觀察，發現其效果良好，其絮凝率可達到80%。并測其COD，方法用消解法測量。

采用硫酸一重鉻酸鉀消解體系，水樣經微波加熱消解后；過量的重鉻酸鉀以試亞鐵靈為指示劑，用硫酸亞鐵銨進行滴定，計算出CODcr值。微波密封消解COD速測儀是用頻率為2450MHz的電磁波（稱為微波）能量來加熱反應液的。在高頻微波能的作用下，反應液分子會產生高速摩擦運動，使其溫度迅速升高，另外還采用密封消解方式，使消解罐內部壓力迅速提高到約203kPa，加快分解速度，大大地縮短了消解時間，與此同時還可以抑制氯離子被重鉻酸鉀氧化成氯氣。另外，在測定時加入適量的硫酸汞作為掩蔽劑，可以測定高氯水中的COD。測得：

脫色前廢水的COD=1813.3mg/l

脫色后的廢水COD =1056mg/l

3.2生物絮凝劑對水中染料絮凝效果

實驗方法 ：在250m L三角瓶中加入100mL濃度為27mg/L的染料溶液，加入一定量的微生物絮凝劑和5mL 10 % CaC12溶液.用稀氫氧化鈉和稀鹽酸溶液調節水樣的PH值攪拌均勻后。靜置24小時后測定上清液的吸光度或色度，同時取等量染料水樣用去離子水代替生物絮凝劑和CaC12溶液作對照實驗。吸光度值用722型分光光度計測定。色度用稀釋倍數法測定。

3.3結果和討論

酸性大紅染料的最佳吸收波長為620nm。實驗染料水樣的色度是500倍。

3.3.1水樣PH對脫色率的影響

固定絮凝劑的加入量為10m L，調節染料水樣不同的pH。實驗結果見圖5-20由圖5-2可見，微生物絮凝劑MBF26對染料的脫色率隨PH的升高而增加。由于第二類污染物最高容許排放標準中規定pH值規定為6^-9，因此，本實驗中研究PH對色率的影響取pH6-9之間.脫色率在PH 6^-8之間變化較大.而在pH8^-9之間脫色率變化很小。最高脫色率可達到76%左右。綜合考慮各項因素，對染料的脫色實驗pH取8.0士0.5為宜，相應的脫色率為74%左右。

3.3.2投加的絮凝劑菌液量的影響

投加不同的絮凝劑的量進行絮凝實驗.實驗時調節建材廢水、CaC1微生物絮凝劑的混和液pH為8.0，脫色率隨微生物絮凝劑的投加量的增加而升高。投加量在0^10 mL之間時，脫色率變化較大。而絮凝劑投加量在10^-20 mL時，脫色率升高速率較緩慢，脫色率最高可達78 %。綜合考慮各項因素，作者認為適宜的絮凝劑投加量為每100 mL染料溶液中，絮凝劑的投加量是10 mL，相應的脫色率為67 。根據適宜的投加量及其相應的脫色率，可算出每mL絮凝劑MBF26可絮凝1.8mg試驗染料。

3.4本章小結

本章研究了所篩選的高效微生物絮凝劑對高濁度的印染廢水的效果，進行了微生物絮凝劑對水中染料和城市污水的絮凝實驗.結果表明，微生物絮凝劑具有顯著的去除懸浮物、脫色等效果。其中5號菌株的城市污水濁度去除率達60%以上絮凝受試的活性G-G染料量為5mg/mL，最高脫色率可達到65%左右。由于培養液中的培養基的顏色偏黑，不然其脫色率可達到更高微生物絮凝劑1，2，5，7號對高濁度的印染廢水的濁度去除率都在50%以上。由于廢水是一種極其復雜，變化多端的介質，不同水質的廢水理化性質不同，因而發揮最佳絮凝效果的微生物絮凝劑的作用條件也不二樣.這是由菌株的遺傳特性、生理生化特征及培養條件決定的。因此微生物絮凝劑作用機理有待進一步研究。

4. 結論

實驗表明，具有絮凝能力的微生物菌種很多，廣泛分布在自然界中。本實驗建立的菌種篩選模型有效，同國內學者的研究結果基本一致。分離出的那株產生菌的培養液對高嶺土懸浮液及各種廢水的絮凝效果明顯，充分顯示了微生物絮凝劑作為一類新型絮凝劑的應用前景由于時間及實驗設備的限制，對微生物絮凝劑的提取、純化，絮凝劑成分分析及絮凝機理等方面有待進一步研究。

參考文獻：

第3篇：微生物的純培養步驟范文

[關鍵詞] 微生物檢驗；質量控制；實驗室間比對試驗

[中圖分類號] R117[文獻標識碼] B [文章編號] 1674-4721（2010）11（a）-072-02

微生物檢測實驗室是疾病預防控制和衛生監督工作十分重要的技術支撐之一，主要承擔著傳染病監測與檢測、衛生細菌學檢測、醫院消毒質量監測及消毒產品檢測等方面的任務，技術手段涵蓋微生物學、免疫學、分子生物學、細胞生物學等學科，其檢測過程的質量控制尤為重要。開展微生物檢測質量控制，參與實驗室間比對和能力驗證活動，對所接受盲樣的分離鑒定工作能提高微生物檢測人員的檢測能力，同時也能提高微生物實驗室檢測各種樣品的技術水平。因此，每年我們都要定期參加淮安市CDC的質控考核活動。現將2009年微生物實驗室間的質控考核及檢驗結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質控樣品：淮安市CDC下發的5 ml螺口塑料試和裝半固體菌種一份，編號1號。

1.1.2 培養基：本次質控所用培養基為江蘇博達微生物試劑有限公司及抗州天和微生物試劑有限公司提供，均在有效期內使用。自配試劑按GB/ T4789―2003配制。

1.1.3 診斷血清：沙門菌屬診斷血清及O1群和O139霍亂弧菌診斷血清由蘭州生物制品研究所生產，在有效期內使用。

1.1.4 質控標準菌株：乙型副傷寒沙門菌標準菌株，菌株號為50004、非O1群霍亂弧菌標準菌株，標準號為N92001。均購自江蘇省博達微生物試劑有限公司。

1.2 方法

《食品衛生微生物學檢驗》GB/T4789―2003[1]、《霍亂診斷標準》WS-2008[2]、《食品衛生微生物學檢驗 沙門菌檢驗》GB/T4789.4―2008[3]。

2 檢驗步驟

2.1增菌培養

無菌操作下開啟試管裝半固體，挑取混勻后的半固體分別接種到下列增菌液，觀察各增菌液生長情況。見表1。

取生長情況渾濁的SC、GN增菌液各1環，分別接種到麥康凱平板、SS平板上，取葡萄糖肉浸液肉湯、營養肉湯各1環分別接種血瓊脂平板和普通平板，取堿性蛋白胨水劃線接種TCBS平板、堿性瓊脂平板，37℃ 24 h培養，觀察各平板上的菌落特征。

2.2分離培養情況

SS平板和麥康凱平板上可見圓形、濕潤、透明光滑中等大小菌落，在SS平板上呈中心褐色；普通平板上有兩種菌落，一種為無色半透明圓形較小菌落，另一種為無色透明扁平光滑濕潤較大菌落；血平板上也有兩種菌落，一種為乳白色圓形不透明小菌落，無溶血環，一種為無色透明扁平較大菌落，有溶血環；TCBS平板上有黃色較小菌落；堿性瓊脂平板上有扁平光滑濕潤透明的較大菌落，無拉絲現象。

2.3 麥康凱及SS平板上挑取可疑菌落以及普通平板和血瓊脂平板上較小菌落

分別從麥康凱及SS平板上挑取可疑菌落以及普通平板和血瓊脂平板上較小菌落進行氧化酶試驗和染色鏡檢。結果：氧化酶-，G-無芽胞短小桿菌。

2.3.1 接種雙糖鐵瓊脂斜面，37℃ 24 h培養。結果均為：斜面-、底層產酸產氣、硫化氫+、動力+。

2.3.2生化試驗及血清學鑒定。

2.3.4挑取斜面上菌苔做下列生化試驗[4-5]，37℃，24~48 h培養，生化結果見表2。

2.3.5血清學鑒定：沙門菌屬A-F群多價O：++++；O4：++++；O12：++；O1：－；O5：－；Hb：++；H5：－；H2：－；Henx：－；Hw：－；鹽水：－。

2.3.6同時用標準菌株50004乙型副傷寒沙門菌作對照，生化試驗、血清學結果基本同上。

2.3.7結果報告：報檢出乙型副傷寒沙門菌（抗原模式為4，12：b）。

2.4 TCBS上黃色菌落、堿性瓊脂平板上菌落、血平板和普通平板上較大菌落

挑取TCBS上黃色菌落、堿性瓊脂平板上菌落、血平板和普通平板上較大菌落做氧化酶試驗和鏡檢。結果：氧化酶+，G-彎曲菌。

2.4.1挑取典型菌落作純培養，再進行血清學凝集試驗。霍亂弧菌O1群多價：－；霍亂弧菌O139：－；鹽水對照：－。

2.4.2 生化試驗。

2.4.3 挑取純培養物做下列生化試驗[4-5]，37℃，24~48 h培養，生化結果見表3。

2.4.4同時用標準菌珠N92001非O1群霍亂弧菌作陽性對照，生化試驗、血清凝集試驗結果基本一致。

2.4.5結果報告：報檢出非O1群霍亂弧菌。

3 結果

依據菌落特征、菌體形態、生化反應結果及血清學凝集試驗，1號質控樣中檢出乙型副傷寒沙門菌和非O1群霍亂弧菌。

將質控樣品檢測結果上報淮安市CDC，結果全部正確。

4 討論

面對當前突發公共衛生事件發生，因涉及范圍廣，危害性大，在社會上日益被重視，這對檢驗技術、速度提出了更高要求[6]。實驗室間比對以及水平測試、能力驗證是體現實驗室質量水平和技術能力最具有說服力的手段，實驗室應盡可能參加與其檢測范圍相關的外部質量評估計劃（如能力驗證）和實驗室間比對試驗。實驗室使用外部質量評估計劃不僅可評定檢測結果的偏差，還可以檢查整個質量管理體系的有效性[7]。微生物檢測實驗室與其他類型實驗室一樣，質量體系的建立與質量控制工作是維系實驗室運作的生命之源，其檢測結果的準確性和可靠性，反映了該疾控中心的技術能力和技術水平。

參加上級衛生部門組織的實驗室間比對試驗，并做好這項工作，是建立在一個較好的室內質控的基礎上，所以做好微生物實驗室質量控制直接關系到日常檢測工作的質量[8]，實驗室室內質量控制是產生精確和可靠結果的基礎和核心[9]。這就要求我們要把室內質量控制工作認真、具體地落實到日常工作的每一個環節中，做試驗時要嚴格遵守微生物檢驗操作規程，配制培養基時要嚴格按照國標中的配方要求制備，并做好配制記錄、效能試驗和無菌試驗，生化反應試劑以及診斷血清要在有效期內使用，定期對培養基、生化反應試劑及診斷血清用標準菌株進行質量控制，所在檢測設備均要進行定期檢定或自校準。同時本次實驗操作過程中，我們將生物安全要求體現在每一個環節中，實驗室的結構和布局按2級生物安全防護實驗室要求，嚴格地注意個人防護，戴口罩、手套，穿工作服，在生物安全柜中操作，將廢棄物放置特定容器，經高壓處理后集中處理。只有做好室內質量控制工作，才能增強室間質量控制結果的準確性和可靠性。

隨著全球經濟一體化進程的日益加快，我國的檢驗市場將全面開放，實驗室將面臨市場經濟的嚴峻挑戰，委托人有自主選擇可信賴、有資質的實驗室做樣品檢測，這就要求實驗室必須轉變觀念，以市場需求為導向，以客戶滿意為中心，以提高質量求生存，以技術能力為依托，堅持科學發展觀，嚴格規范各類檢測行為，堅持不懈地不斷提高檢驗人員的檢測技術水平，確保提供給委托人的檢驗結果科學、準確、公正。

[參考文獻]

[1]衛生部，國標委．GB/T4789―2003食品衛生微生物學檢驗[S]．北京:中國標準出版社,2008:33-100,239-247．

[2]衛生部政策法規司．WS-2008霍亂診斷標準[S].北京:人民衛生出版社,2008:1-10．

[3]衛生部,國標委．GB/T4789.4―2008食品衛生微生物學檢驗沙門氏菌檢驗[S].北京:中國標準出版社,2008:1-10．

[4]何曉青.衛生防疫細菌檢驗[M].南昌:新華出版社,1989:306-308,341．

[5]孟昭赫.食品衛生檢驗方法（微生物部分）[M].北京:人民衛生出版社,2003:126-128．

[6]巴德才仁.實驗室微生物檢驗質控結果分析[J].中國衛生檢驗雜志,2009,19(12):2978-2979．

[7]質量監督檢驗檢疫總局.GB/T 27405―2008實驗室質量控制規范食品微生物檢測[S].北京:中國標準出版社,2008:15．

[8]楊美琴,孫來玉,王鳳云.微生物實驗室質量控制與管理[J].職業與健康,2008,(2):68-70．

第4篇：微生物的純培養步驟范文

論文摘要：針對我院以往的微生物實驗教學中存在學生動手能力不強的問題，筆者采用改善實驗條件、優化實驗內容、重視預習、鼓勵學生參與實驗準備和教師科研課題，考核方式多樣化等方式對微生物實驗教學進行了改革。結果表明，通過教改提高了學生觀察、思考、分析和解決問題的能力，培養了學生勤奮、嚴謹的學風和科學的態度，學生不僅牢固地掌握了微生物學的基礎知識和基本概念，而且初步具備了從事微生物應用和研究所需的基本方法和技能，為他們將來工作或進一步深造奠定了較好的基礎。

微生物學是生物類學科一門重要的專業基礎課，它涉及面廣、應用性強、受益面寬、發展迅速，既是生命科學理論研究的核心，又是一門應用性極強的學科，對生命科學和生物工程技術的發展起著巨大的推動作用。微生物學實驗是微生物學的重要組成部分，是現代生物學技術的重要基礎，其獨特的實驗技術在學科的發展中占據著突出的位置。我院微生物實驗課面向生物工程、食品工程、生物技術、水產養殖等專業開設。為使這些專業的學生能熟練掌握微生物學實驗技術和操作規程，培養他們觀察、思考、分析和解決問題的能力，增強他們的創新意識，樹立實事求是、嚴肅認真的科學態度以及勤儉節約、愛護公物的良好作風，我們從2003年開始對各專業微生物實驗課做了相應改革探討，以期達到較好的效果。

一、 我院以往的微生物實驗教學存在的問題

1.教師包辦多，儀器經費有限，造成學生動手少。

我院以往的實驗課教學從教學內容的選擇、實驗思路的設計、實驗器材的準備，甚至實驗的預期結果都由教師一手包辦，到實驗課上學生只是按照教師的指令按部就班地完成而已，這就造成了學生的依賴思想，課前不預習，實驗過程中不認真、不主動，結果分析不到位。另外由于儀器設備及經費限制，一個小組往往2—4人，實驗中有人做，有人看，有人當記錄員，這樣部分學生養成不愛動手的毛病，只要“認真”抄襲同組同學的數據照樣能寫出完美的實驗報告。這樣不僅錯過了動手能力培養的機會，而且養成了投機鉆營的惡習。

2.時間安排不合理，不利于學生觀察分析。

微生物學實驗課時間安排一般較緊，每周1次或兩周1次，每次3—4學時，有些實驗內容，如微生物的分離、培養、生化反應、生長曲線測定等，需要培養18小時以上才能觀察分析結果，一次實驗課難以完成。如果第二次課再觀察結果，就難以保證實驗結果的正確性和連續性，因此教師通常自行安排課間或課余時間進行。有些小組不來，有些小組派代表來觀察，即使全部到齊，也由于時間短而緊張，導致學生觀察不仔細，出現問題也無心分析和解決，由此影響了分析和解決問題能力的提高。

3.考核方法單一，導致學生忽視實驗操作過程。

以往學生成績的評定主要看實驗報告，學生單純地為實驗報告而做實驗，一旦操作出現錯誤或沒有達到預期的實驗效果，不是就此分析原因、總結教訓，而是為了實驗報告得到教師的“好評”而編造數據，甚至抄襲他人的結果。這種考核方式也導致了學生對實驗過程的不重視。

4.前后項目安排不合理。

以往的實驗項目，內容連貫性不強，一學期下來，學生感覺做了不少實驗，但實際應用時不知所措，無從下手。

二、教學改革采取的方式措施

1.提高認識，合理利用現有條件。

我院微生物課程組的十多名教師，在分析問題的基礎上，集思廣益，統一認識，改變過去一包到底的做法，給學生動手留出足夠的空間。學校近年來也加大了資金投入，不僅實驗室寬敞明亮，實驗所需儀器設備一應俱全，還添置了不少精密儀器，如奧林帕斯數碼攝影顯微鏡、全自動熒光顯微鏡、大小不等的生物反應器、全溫振蕩培養箱、冷凍干燥機、超聲波粉碎機等，這樣既保證了實驗教學的高質量完成，又給教師提供了很好的科研條件，教師吸納學生參與科研活動，又進一步促進了學生動手能力的提高。

2.合理安排實驗內容及開出順序，增強其連貫性和實用性。

我院的微生物實驗內容既要考慮基礎知識和基本技能的培養，又要照顧各專業的特點，所選內容應覆蓋微生物學的基本操作技能，尤其應突出微生物學獨特的基本技術，如顯微鏡技術、無菌操作技術、接種和分離技術、培養技術等，既有簡單的、基礎的小實驗，又有一些設計性和綜合性實驗，注意實驗技術與基礎理論的銜接，同時避免與其他學科實驗內容的重復，以便于學生建立正確、全面的實驗概念。

首先，在總體上，強調基礎性和系統性，突出微生物學的基本實驗方法和基本操作技術，如微生物形態結構觀察中的染色技術，培養基的制備及各種滅菌技術，微生物的分離、純化、培養及保藏技術，微生物生理生化特性測定技術及無菌操作技術等。其次，從專業的特點以及將來可能從事的工作性質出發，盡量安排一些選修的內容。第三，從簡單的驗證性實驗向綜合性實驗發展，將有關實驗內容有機結合起來，安排在一次實驗課上或前后連接，既節約了課時，又增強了實驗的綜合性，也有助于學生判斷、分析能力的提高。如將細菌革蘭氏染色與細菌特殊結構觀察、測微技術、顯微鏡直接計數法結合，微生物分離、純培養技術與微生物鑒定結合，微生物紫外誘變與平板菌落計數法結合，各種理化因素對微生物的影響與微生物對碳、氮源利用的結合，微生物生長曲線的測定與生理生化反應的結合等。實驗改進后，一環緊扣一環，中途如有一次失敗，就會影響到以后的實驗結果，這樣學生對自己的結果關心得多了，動手操作的興趣和能力也大大提高了。

3.重視課前預習，積極參與實驗準備工作。

微生物實驗內容比較繁雜，因課時限制，有時一次課要做多個實驗項目，如果實驗前不進行充分的預習，學生只能按板書內容和教師所講悶頭去做，對實驗的全過程就知其然而不知其所以然，這樣勢必影響學習效果。所以我們要求：（1）每次實驗前，學生必須閱讀有關內容，了解實驗目的、原理和內容，在做實驗之前對要做什么、怎么做、關鍵步驟有哪些、預期效果如何等要做到心中有數，這樣減少了實驗的盲目性，做起來就會得心應手。（2）讓學生參與實驗準備工作，如玻璃器皿的洗滌、包扎，無菌水的分裝、滅菌，試劑和培養基的配制，儀器的調試、保養等工作，這樣不僅緩解了教師人手不足的問題，更重要的是增加了學生動手的機會。同時學生在準備實驗的過程中，還學到了實驗課之外的知識，增強了責任感，培養了嚴肅認真的科學態度。此外，學生和教師一起準備實驗還有利于師生的溝通，便于教師及時發現問題，糾正錯誤。

4.提問精講加小結，切實提高課堂效果

課前要求預習，但部分學生自覺性較差，如果不檢查，預習就會流于形式。因此，實驗課開始時，教師對要求預習的內容以提問的方式進行抽查，或者提前幾分鐘先讓學生簡要試講，然后由教師給予補充和糾正。既可以強調重點，又可以使學生記憶深刻。

教師精講，關鍵示范。教師的講解和示范是必不可少的環節，但必須簡潔明了，講清該實驗的實際應用、關鍵步驟、具體要求和歷屆學生易出現的錯誤等問題，關鍵操作要進行演示。盡可能騰出更多的時間讓學生多動手、多練習，充分發揮學生的主體作用；實驗過程中，教師巡回指導，細心觀察學生操作的每一個環節，隨時發現正在發生或可能發生的問題，發現問題教師時親自動手示范，及時糾正錯誤，做到一絲不茍，培養學生嚴謹的學風和科學的態度。為了加深學生們的印象，還可抽時間讓學生過關簽名，努力做到讓每位學生都能正確、熟練地掌握微生物學的基本實驗技巧。鼓勵學生勇于創新，引導他們多觀察多思考。如果實驗中出現異常，不要輕易放過，教師要引導學生認真分析，找出原因，提出改進意見，并在條件允許的情況下，鼓勵學生重新實驗，這樣可以使學生收益更大。

下課前小結，是大家容易忽視的問題，發揮得好可以起到畫龍點睛的作用。由于學生之間的差別、教學安排、技術因素等原因，容易使實驗課結束時草草收場，結果一些學生的疑點和錯誤得不到及時解除和糾正，這一點在操作考試時表現得非常明顯。因此教師應在每次實驗課結束前，最好利用很短的時間對本次實驗進行小結，糾正普遍性的問題，解釋某些實驗現象，表揚實驗做得好的小組或學生。實驗結束后要求學生將用過的物品清洗干凈，擺放整齊，原始數據經教師看過簽字后才能離開實驗室，以此培養學生嚴謹的學風和科學的態度。

5.鼓勵學生參與科研課題，拓展視野。

實驗課因受課時、資金等因素的限制，只能安排一些最基本的內容（與前面的綜合性實驗內容有矛盾，看看如何調整）。較深的內容、耗時較多的內容、顯示專業特色的內容就不可能面面俱到，唯一的辦法就是課外彌補。我們在教學中體會到，不少學生希望動手，掌握更多知識的欲望非常強烈，就看教師怎么去引導。食品專業的學生喜歡食品原料或產品中微生物指標的檢驗，生物工程專業的學生則喜歡利用微生物來生產工業產品，生物技術專業的學生則想利用微生物生產基因產品，水產養殖專業的學生則想篩選生物制劑，防治水產動物疫病。根據以上情況，我們提倡學生通過參與教師科研課題，“自謀生路”；申請學校和系部立項的學生課題，“找米下鍋”，期末參加綜合大實驗，或者組建興趣小組等形式提高自己的綜合能力，實驗室也全天候為他們開放，教師主動熱情地為他們“分憂解難”，形成了較好的學習氛圍。有的選了食用菌菌絲體培養及DNA提取，有的選了食用菌栽培，有的選了市場酸奶樣品的檢測，有的選了海洋微生物產抗生素或者產酶菌株的篩選等等。選題之后，學生們一邊去上網或圖書館查資料，了解前人的研究成果，一邊編制自己的計劃，摸索實驗條件，干得不亦樂乎，實驗結束時提交總結報告或者論文。通過鍛煉，學生們開闊了視野，提高了分析問題和解決問題的能力。從前幾屆畢業的學生看，參加各種訓練的學生做畢業論文時能很快進入角色，論文的水平也大大提高，有些學生在畢業前后就有一兩篇；另外，通過鍛煉，學生適應社會的能力強了，有些學生還沒畢業，就利用自己所學的微生物知識幫家人和親友脫貧致富，幫企業分析市場，研究開發新產品。

6.考核方式多樣化，將操作能力培養貫穿始終。

我們的微生物學實驗與理論可單獨設課。實驗課的考核包括平時考核和期末考核兩部分。教師制定合理的考核標準，并在第一節課予以公布。平時考核成績占總成績的60％，主要考核學生的出勤、預習、回答問題、實驗操作的態度和結果以及實驗報告的寫作水平。期末考核包括操作考核和實驗理論筆試，占總成績的40％。操作考核內容包括器皿的包扎、接種和制片技術、顯微觀察、微生物分離和培養、微生物計數、培養基的配制及滅菌等，教師對這些內容進行編號，讓學生抽簽進行單人考核，形式以動手操作為主，輔加一些口試，操作不及格者必須補考。實驗理論筆試內容包括原理、試劑用途、注意事項、結果分析、實驗方案的設計等。通過考核，督促學生進一步熟悉實驗內容和儀器的使用方法，彌補了實驗中的不足。考前許多學生主動到實驗室查漏補缺，反復操練，生怕出錯，在一定程度上起到了積極的作用。另外，考核學生的同時也是對教師的教學效果的檢查，因此對教師改進教學也有一定的促進作用。

7.建立實驗項目卡和實驗檔案，為進一步教改提供積累。

實驗檔案的收集，是一個學校教學成果的體現，也是教學經驗的積累和進一步改革的基礎，這個思想始終貫穿于我們的教學過程。每個實驗項目建有卡片，每個卡上有實驗目的、原理、操作要點、注意事項、所用的儀器臺套數，消耗材料的多少等內容，即使新手準備實驗也會一目了然。檔案中有教師的預實驗報告，記載著教師的試做過程、心得體會和改進意見，實驗員有準備實驗記錄和開出記錄，實驗設備記錄本上有使用記錄，教學檔案室存有歷屆學生的實驗報告、綜合大實驗的總結報告、學生的平時成績記錄、實驗理論考試試卷和總評成績，這些原始材料的積累，為以后的改革提供了很好的參考。

三、總結經驗，深化改革

1.教學改革后的效果

通過以上改革，學生認識到了本課程的重要性，大大激發了他們上好實驗課的熱情；更加牢固地掌握了微生物學的基礎知識和基本概念，具備了從事微生物應用和研究所需的基本方法和技能，為后續課程的學習和將來順利完成畢業論文提供了有力保障；提高了他們觀察、思考、分析問題和解決問題的能力，培養了勤奮、嚴謹的學風和科學的態度，為他們將來工作或進一步深造奠定了較好的基礎。

2.深化改革的設想

21世紀是知識經濟的時代，是充滿競爭的時代，這種競爭的核心是人才的競爭，因此，作為高等教育，培養“厚基礎、寬口徑、強能力、高素質”的高質量人才是時代的要求，其具體表現在：（1）具有滿足工作的知識和基本工作能力；（2）獲得新知識、新技術的能力；（3）具備科研創新的基本素質和能力。

對照21世紀對人才的需求，我們還有許多工作要做，總結起來有以下幾點：（1）進一步加大資金投入，添置與適應現代科技發展的儀器裝備，爭取更多的科研項目，使更多的教師和學生投入進來。（2）加強教師和實驗技術人員自身的學習，不斷提高業務和技術水平，將更多的新方法、新技術介紹給學生，更好地發揮教師的主導作用。（3）加大微生物學實驗室對學生的開放程度，包括時間、空間和實驗項目的開放，使學生有更多的機會和自由空間去選擇實踐，進一步提高他們分析問題、解決問題和科技創新的能力。

參考文獻:

[1]董新嬌，吳楚.微生物學教學改革的探索[J].溫州師范學院學報(自然科學版) ，2002，23（3）:76-78.

[2]范黎，劉明，張偉等.微生物學實驗課教學改革的點滴體會[J].微生物學通報，2001，28(4)： 96-99.

第5篇：微生物的純培養步驟范文

大量的研究表明，果膠作為腸道益生因子，有利于腸道中乳酸菌、雙歧桿菌的生長，產生豐富的SCFAs（short-chainfattyacids）改善腸道pH，促進腸細胞生長，抑制結腸癌等[5-8]。前人研究結果暗示果膠可能具有改善辣椒素引起的腸道環境的不適癥狀。薛荔做為一種野生常綠攀援植物常見于我國各省，適應力強，易于種植。并且瘦果籽中含有豐富的果膠，研究表明薛荔籽果膠酯化度為38.57%，屬于酸性低酯果膠[9]。因此，本實驗選擇薛荔籽果膠作為添加物，考察果膠添加是否會改善辣椒素引起的腸道不適。由于體外發酵作為動物實驗的補充有很多優點：它可以跟蹤發酵過程中物質的變化及研究發酵產物的形成過程，彌補了體內發酵不能實現動力學檢測的缺點；它還可以實現標準化操作，實驗的重復性強。因此，本文擬采用體外發酵試驗觀察果膠與辣椒素對腸道發酵環境的影響，以期為辣椒的科學消費提供理論指導。

1材料與方法

1.1材料與試劑薛荔果膠由實驗室研究自制。天然辣椒素(辣椒堿含量為95.7%)由河南倍特生物科技有限公司提供。氯化鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、硫酸（優級純）、亞硝基鐵氰化鈉（分析純）、苯酚（分析純）、次氯酸鈉（分析純）、冰乙酸（分析純）、吐溫80（分析純）、氯化銨（分析純）、咔唑（分析純）成都市科龍化工試劑廠；乙酸(色譜級)AJohnsonMattheyCompany；巴豆酸（色譜級）、丙酸(色譜級)、丁酸(色譜級)、異丁酸(色譜級)梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；EMB培養基（生化試劑）北京奧博星生物技術有限公司；BS培養基（生化試劑）、LBS培養基（生化試劑）青島海博生物技術有限公司；D-半乳糖醛酸（分析純）北京索萊寶科技有限公司；高純二氧化碳氣體（99.999%）重慶朝陽氣體有限公司。

1.2儀器與設備Sepctrumlab22可見分光光度計上海棱光技術有限公司；WH-1微型旋渦混合儀上海滬西分析儀器廠；JA2003A電子天平上海精天電子儀器有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風干燥箱上海齊欣科學儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計上海大普儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋金壇市富華儀器有限公司；5810型臺式離心機德國Eppendorf公司；SIGMA低溫離心機德國SIGMA公司；ARI14紫外分光光度計上海愛朗儀器有限公司；GC-2010氣相色譜日本島津公司；KQ-100超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；HH-B11電熱恒溫培養箱上海躍進醫療器械廠；BC-J160S二氧化碳細胞培養箱上海博迅實業有限公司醫療設備廠；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋KAGOSHIMASEISAKUSYOINC；ZHWY-100C恒溫培養振蕩器上海智誠分析儀器制造有限公司；Stabilwax-DA毛細色譜柱美國RESTEK公司。1.3試驗方法

1.3.1果膠提取與測定

1.3.1.1果膠提取[10]稱量薛荔籽，在水浴鍋中提取（料液比：1:10（m:V）、60℃攪拌2h）。方法一：真空濃縮濾液——真空冷凍干燥——粉碎——成品薛荔籽膠。方法二：AB-8型大孔樹脂脫色過濾——真空旋轉濃縮至1/3——用95%乙醇沉析，靜置一夜——用65%乙醇洗滌兩次——真空冷凍干燥——粉碎——成品薛荔籽果膠。

1.3.1.2果膠純度測定[11]標準曲線繪制：精確稱取D-半乳糖醛酸標準品10mg，用蒸餾水定容于100mL容量瓶中，制成100μg/mL的標準溶液。移取上述標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于25mL具塞刻度試管中，再加入蒸餾水稀釋至1mL，即得一組濃度為0、20、40、60、80、100μg/mL的半乳糖醛酸標準液。然后小心沿管壁分別加入6.0mL濃硫酸，在沸水浴中加熱20min，取出冷卻至室溫，再分別加入0.2mL，1.5g/L咔唑-乙醇溶液，搖均。在暗處放置30min，取出測定反應液在波長526nm處的吸光度，用蒸餾水做空白實驗，制作標準曲線：y=0.0116x–0.002，R2=0.9981。稱取10mg實驗室自制薛荔籽果膠，溶解后定容至100mL容量瓶中，吸取1mL果膠溶液至25mL比色管做上述處理，根據標準曲線計算D-半乳糖含量。

1.3.2發酵液制備

1.3.2.1發酵液配比通過查閱大量相關文獻及本研究室前期的實驗表明，對采用不同劑量灌喂一月后的大鼠進行詳細的檢測后，發現添加5%果膠就能明顯增加大鼠盲腸內容物中SCFA總量，而添加0.1%辣椒素組的大鼠其血脂變化及對腸道的傷害作用最為明顯。發酵液各物質添加量見表1。其中果膠根據接種盲腸內容物重量的5%添加，辣椒素根據發酵液總體積添加（m:V），添加量為0.1%。

1.3.2.2體外發酵步驟1)無菌條件下取出6只雄性大鼠的盲腸內容物，裝入預先滅菌的50mL帶蓋離心管中，稱重，鼓入高純CO2氣體5min，蓋上蓋子待用。2)用9倍(V:m)無菌生理鹽水稀釋盲腸內容物，渦旋震蕩5min混勻，4層紗布過濾。3)取12支100mL高溫滅菌后的高溫瓶，每支高溫瓶中加入5mL盲腸內容物濾液和45mL滅菌基礎培養液（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g，pH7.0~7.2，定容至1000mL），將高溫瓶分為4組（每組3支），按實驗要求分別加入果膠或辣椒素（見表1），鼓入高純CO2氣體20min，蓋好橡膠塞后蠟封。在60~80r/min轉速的恒溫培養振蕩器上37℃搖床培養10h，終止發酵，檢測發酵液中pH、游離氨、SCFA及微生物。

1.3.3生化指標檢測

1.3.3.1pH測定發酵液樣品5mL于4000r/min下離心5min，吸取上清液2mL，用精密酸度計測上清液pH。

1.3.3.2發酵液游離氨測定無氨水制備[12]：在1000mL蒸餾水中，加入0.10mL硫酸（ρ=1.84g/mL）。并在全玻璃蒸餾器中重蒸餾，棄去前50mL餾出液，然后將餾出液收集在帶有玻璃塞的玻璃瓶中。發酵液樣品于4000r/min下離心5min，吸取上清液1mL，依次加入1mL含有0.001mol/L亞硝基鐵氰化鈉的0.5mol/L苯酚溶液和1mL含有0.03mol/L次氯酸鈉的0.625mol/L氫氧化鈉溶液，60℃保溫5min，625nm波長下測吸光度[13]。配制5mmol/L氯化銨溶液，分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL溶液于4mL比色皿中，無氨水稀釋至1.0mL，按上述步驟測吸光值，繪制標準曲線：y=0.108x+0.008，R2=0.9991。

1.3.3.3發酵液SCFA測定盲腸內容物發酵液樣品在4000r/min轉速下離心15min，吸取上清液轉移至超純水預處理過的10mL離心管中，10000r/min轉速下繼續離心15min，1mL一次性注射器吸取上清液1mL，0.22μm濾膜過濾至2mL進樣小瓶中待測[14]。氣相色譜條件：進樣量1μL；進樣口溫度220℃；柱流量0.95mL/min，柱溫90℃、平衡時間0.5min，5℃/min升溫至150℃，保留時間7min；檢測器溫度230℃；氫氣流量40mL/min，空氣流量400mL/min，尾吹流量40mL/min[15]。

1.3.3.4發酵液微生物測定取發酵液1mL，加入9mL無菌生理鹽水，依次10倍稀釋至10-7。選擇10-5、10-6、10-7三個稀釋度，用于大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的培養計數，接種量為100μL。大腸桿菌培養選用EMB培養基，37℃下恒溫培養箱中培養48小時計數。雙歧桿菌和乳酸桿菌分別選用BS培養基和LBS培養基，將培養皿蠟封后，在37℃下二氧化碳細胞培養箱中厭氧培養72小時計數。結果以logcfu/mL表示。

1.4統計分析實驗結果以mean±SD表示，各組間顯著性差異采用SPSS分析，P<0.05被認為有顯著差異。

2結果與分析

2.1薛荔籽果膠純度稱取10mg薛荔籽果膠溶于100mL蒸餾水中，取1mL果膠溶液，按照3.2.1.2方法測得吸光度為0.11，對應D-半乳糖醛酸含量為9.655μg/mL。果膠純度為96.55%。

2.2發酵液pH變化趨勢pH以盲腸內容物量計算，各發酵液pH變化見圖1。從圖1可以看出：在各發酵液的初始pH值為5.9的條件下，實驗結果顯示，相比空白組而言，添加5%果膠的發酵液（P組）pH顯著降低，而添加0.1%辣椒素的發酵液（C組）pH則顯著升高（P<0.05）。添加5%果膠+0.1%辣椒素的發酵液（P+C組）pH相比0.1%辣椒素組（P組）顯著降低。發酵液中pH值的變化主要是由發酵產生的有機酸和游離氨所影響，pH的降低或升高表明有機酸含量或游離氨濃度可能發生了顯著的變化。

2.3發酵液游離氨變化趨勢果膠和辣椒素對盲腸內容物發酵液中游離氨濃度的影響結果見圖2。從圖2可以看出：相對于空白組，添加5%果膠（P組）能顯著降低的發酵液中游離氨濃度，而添加0.1%辣椒素（C組）則明顯增加了的發酵液游離氨濃度（P<0.05）。相對于辣椒素組（P組），添加5%果膠+0.1%辣椒素（P+C組）則明顯降低了辣椒素引起的游離氨濃度的升高（P<0.05）。這與發酵液中pH值的升高和降低相對應。

2.4發酵液短鏈脂肪酸變化趨勢果膠對辣椒素引起的盲腸有機酸發酵產物減少的改善效果見圖3、圖4、圖5及圖6。從圖中可以看出：與對照組相比，添加5%果膠（P組）的盲腸內容物發酵液中乙酸、丁酸、丙酸和總短鏈脂肪酸濃度均顯著升高（P<0.05），而添加0.1%辣椒素組（P組）則顯著降低了盲腸內容物發酵液中乙酸、丁酸、丙酸和總短鏈脂肪酸濃度（P<0.05）。添加5%果膠+0.1%辣椒素的發酵液（P+C組）的短鏈脂肪酸含量相比0.1%辣椒素組（P組）顯著升高（P<0.05）。此結果表明，辣椒素抑制了腸道益生菌對碳水化合物的發酵，減少有機酸的產生，而添加果膠能夠有效改善辣椒素對腸道益生菌發酵所產生的不利影響。2.5發酵液微生物數量變化趨勢果膠和辣椒素對盲腸內容物發酵液中微生物組成的影響見圖7、圖8及圖9。從圖中可以看出：相對于對照組，添加5%果膠組（C組）能顯著增加發酵液中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量，減少大腸桿菌的數量，而辣椒素組(P組)則減少了發酵液中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量，增加大腸桿菌的數量（P<0.05）。添加5%果膠+0.1%辣椒素發酵液（P+C組）的乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量相比0.1%辣椒素組（P組）顯著升高，而大腸桿菌數量則顯著降低（P<0.05）。此結果表明，辣椒素抑制了腸道益生菌的生長，同時使得有害菌的數量增加，而添加果膠能夠有效改善辣椒素對腸道微生物菌群所產生的有害作用。

第6篇：微生物的純培養步驟范文

關鍵詞 生物學 微生物工程實驗 教學改革

中圖分類號：G642文獻標識碼：A

微生物工程是一門含有現代生物科學和工程技術的專業課程，是蘇州大學生物技術專業學生的一門專業核心課程。目前，蘇州大學生物學專業包括生物科學、生物科學（師范）、生物技術、生物信息學、應用生物學、生物技術（食品質量與安全）等6個本科專業（方向）都開設了微生物工程實驗課程。在以往幾年的實驗教學實踐中我們發現，由于各專業教學大綱的不同，導致微生物工程實驗課時不統一，從18學時到36學時再到54學時，因此實驗內容需要不斷更改，導致部分實驗內容孤立、不系統、不連貫，并多為驗證性實驗。隨著這幾年實驗室建設的推進，開設微生物工程實驗所需要的儀器設備有了極大的補充，現在可以開設的實驗特別是設計性實驗的數目大大提高。我們總結了前幾年的教學經驗，在教學體系、教學方法和學生綜合素質培養等方面進行了探索，逐步完善了基礎、綜合、創新三個層次的實驗內容，并建立了一套能夠適應不同專業不同課時的微生物工程實驗課程教學體系，形成了一定的實驗教學特色。

1 實驗課程教學體系的改革

由于我校的微生物工程實驗課程涉及的專業較多，且各專業學生已有的知識積累以及需要掌握的實驗知識和技能也有所區別，因此我們根據實際情況，重新構建了微生物工程實驗課的實驗項目，所有實驗都是綜合型或設計型實驗。這些實驗項目主要分為四方面：第一方面是菌種的篩選、鑒定和誘變實驗，這屬于發酵工程上游的內容；第二部分是環境條件（溫度、pH值、溶氧）對分批發酵的影響及其控制，這屬于發酵工程中游的內容；第三部分是發酵產品的分析，這屬于發酵工程下游的內容；第四方面是發酵產品如酒釀、葡萄酒、凝固型酸奶的制作。

1.1 根據實驗大綱，改革實驗內容

由于微生物工程實驗的內容具有連續性，所以在安排課表的時候宜將這些實驗集中安排在一周或兩周內進行。根據各專業（方向）教學大綱所規定的學時，有選擇地開設幾個實驗，為了提高實驗效率，這幾個實驗通常同時進行。一般來說，上游和中游實驗均必選一開設，下游實驗和發酵產品制作的實驗必開。如果一個班級的學生人數太多，須將中游實驗分批輪流選擇開設。

將整個微生物工程實驗的內容進行系列化、單元化編排，以利于學生對微生物工程知識及實驗技能的系統化掌握，有利于培養學生的動手能力、綜合運用知識的能力和創新能力。通過多動手、多訓練，學生對微生物工程實驗課程體系有了一個全面的認識，同時實驗技能也得到了進一步提高。

1.2 增加自主設計性實驗

在新的教學大綱中，增加自主設計性的實驗，如有用化合物生產菌株的篩選，讓學生在查閱文獻的基礎上，自行設計實驗方案。然后根據設計的方案進行實驗，在實驗進行中肯定遇到各種各樣的問題，讓他們始終處于發現問題、分析問題和解決問題的過程中。此舉極大地調動了學生的自主性、積極性和創造性。若學生遇到解決不了的問題，教師給予及時指導。這樣，通過自己的努力和教師的指導而完成的實驗，學生的印象更深，收獲更大。

1.3 開設傳統發酵食品、飲料實驗

在生物學的所有專業（方向），我們都確定酒釀、葡萄酒、凝固型酸奶的制作為必開設實驗。因為微生物工程（又稱發酵工程）是一門與生產、生活實際密切相關的課程，早在2000多年前，發酵技術就被人們用來生產各種酒和風味食品，今天，發酵食品和飲料仍在我們生活中占有重要地位。在這三個實驗中，每個學生都興致高昂地動手制作酒釀、酸奶、葡萄酒，實驗結束時，每個學生都能品嘗到自己的勞動成果，大家分享著成功的快樂與喜悅。這三個實驗也是我們微生物工程實驗的亮點，有的學生后來還會在家人、親朋面前露一手這些制作技術，有的學生畢業多年后對這些實驗仍記憶深刻。

2 實驗教學方法的改革

合理的實驗內容和體系還需要有相應的教學方法作保障，才能最終達到培養應用型、創新型人才的目的。①在實驗教學方法的改革中，要突出學生的主體地位，教師發揮主導作用，啟發促進學生的思考，點撥學生的思維。

2.1 利用視頻輔助實驗教學

在講解發酵罐的結構時，往往由于學生多，造成部分同學看不見或看不清。鑒于這種情況，我們事先對這部分內容錄制了一個視頻，在實驗課上，我們采取邊講解實物邊觀看視頻的方法就基本解決了這個問題。有的實驗操作，老師在講解完后還可放一段相關的實驗視頻給學生觀看，讓大家有一個更直接的感官認識，這些視頻可以通過網絡搜索引擎或國內外大學的相關專題網站獲得。②

2.2 實驗分組的改革

以往有些實驗，由于實驗條件的限制，每小組學生人數多，造成有的同學袖手旁觀或者不能參與實驗，實驗教學效果不佳甚至產生負面影響。事實上，學生作為實驗課的主體，實驗的每個環節和步驟都必須親自參與進來。所以，我們在安排每個實驗時，會根據實驗內容、實驗條件和班級人數進行合理分組，確保每個同學都有動手的機會，確保能做實驗而不是看實驗。例如，酒釀和酸奶必須每人都做，每人制作出來的產品最后須經老師評分，作為成績的一部分，這樣就能有效避免學生偷懶或逃課。

3 重視學生綜合素質的培養

3.1 培養團隊合作精神

綜合性和設計性實驗是培養學生綜合利用所學的多門知識和技能而開設的一種復合型實驗，但實驗時間較長，勞動量大，而且這些實驗對實驗設備的依賴性比較強，實驗過程中很難保證每人一臺發酵罐或者滅菌鍋，只能分組、分批進行。因此對此類實驗，我們采取團隊合作的形式，將學生分為若干個組，每組3~5人，安排組長，所有實驗都由小組共同完成，組長合理安排本組成員完成相應的工作量。比如“環境條件（溫度、pH值、溶氧）對分批發酵的影響及其控制”實驗是在發酵罐中連續進行30小時左右，過程中需要定時取樣和對相關指標進行測定，需要熬夜，小組成員間可以協調安排值班。每個小組成員必須認真對待，確保自己負責的實驗部分正常進行，實驗結果準確可靠，否則自己的小疏忽或失誤就會導致整個小組大實驗的失敗。所以，最后的實驗結果是由大家集體合作貢獻得到的，根據每個人得到的實驗結果繪制成發酵過程曲線，這樣的合作有利于培養學生的責任心和團隊精神。

3.2 強化科研意識

為了強化學生的專業素質，在單組實驗的設計和安排上注重學生科研能力的培養和訓練。通過有代表性的實驗方案設計過程，加深對相應知識重點、實際應用的理解。例如在酵母細胞純培養的實驗中，引導學生對影響細胞生長的若干因素進行優化，將正交設計實驗思想引入實驗中，訓練學生掌握這一重要方法，并學會應用極差和效應圖對實驗結果進行分析。這類實驗，只有題目，而結論未定，有利于激發學生的探索興趣和學習的積極性、主動性。培養學生的獨立性和創造性，學生以研究者的身份進行工作，始終處于獨立思考和積極探索的過程中。這類實驗和科研相結合，有利于把科研的思路和方法更形象地傳授給學生。

4 結語

通過微生物工程實驗，讓學生了解和掌握了發酵產品的生產過程，加深了對理論課中基本知識和原理的理解，同時又鍛煉了他們的動手能力和綜合分析實驗結果的能力。通過對微生物工程實驗課程教學體系的完善和改進，加強了與實際生產和科研工作的聯系，使學生積極主動地參與到實驗中來，讓他們懂得實驗課不僅僅是做實驗和完成實驗的簡單過程，更重要和具體的工作在實驗過程之外。通過訓練，使學生在實驗方案設計、實驗過程控制和實驗數據分析整理等方面都有了長足進步，提高了學生獨立開展科研實驗的能力。只有這樣，才能實現目前倡導的從應試教育向素質教育的轉變，滿足21世紀對綜合型人才的需求。

注釋

第7篇：微生物的純培養步驟范文

摘要：

為維持亞硝化反應器穩定運行提供微生物理論基礎，以常溫（18～21．5℃）低基質推流式亞硝化反應器為對象，解析其穩定運行期間功能菌群特征．通過檢測反應器三氮變化檢驗其亞硝化效果．利用掃描電鏡（SEM）觀察污泥微觀結構，通過熒光原位雜交（FISH）、變性梯度凝膠電泳技術（DGGE）及克隆測序等方法，解析微生物菌群特性．保持反應器低溶解氧環境（0．1～0．6mg／L），使氨氧化菌（AOB）競爭力強于亞硝酸鹽氧化菌（NOB），在連續流運行80d內，平均亞硝化率幾乎為100％，出水NO2－－N與NH4＋－N比穩定在1．11．SEM結果顯示，亞硝化污泥中球形細菌為優勢菌群．FISH結果顯示，AOB與NOB的相對比例分別為37．3％與4．4％．PCR－DGGE結果表明，反應器內存在6類優勢微生物菌群，其中Nitrosomonassp．為功能微生物AOB．由多種微生物組成的功能菌群維持反應器亞硝化穩定運行．

關鍵詞：

亞硝化；功能菌群；常溫；低基質；氨氧化菌；亞硝酸鹽氧化菌

傳統生物脫氮工藝經過硝化和反硝化作用兩個階段完成脫氮過程，硝化反應包括氨氧化與亞硝酸鹽氧化兩個過程，分別由氨氧化菌（AOB）和亞硝酸鹽氧化菌（NOB）負責完成．亞硝化過程就是使硝化反應停留在氨氧化階段，避免亞硝酸鹽被氧化成硝酸鹽，從而形成亞硝酸鹽積累．若亞硝化過程與后續厭氧氨氧化工藝耦合（PNANAMMOX），則只需要將57％的氨氧化成亞硝酸鹽，剩余的氨氮與亞硝酸鹽按如下反應式完成脫氮過程。與傳統硝化／反硝化脫氮作用相比，PNANAMMOX理論上可節省62．5％的曝氣能耗，無需有機碳源，且污泥產量低，受到廣泛關注［2］．若要維持常溫低基質生活污水PNANAMMOX工藝穩定運行，關鍵在于實現穩定的亞硝化過程，即PN反應器出水NO2－與NH4＋比值穩定，實質就是控制條件促進AOB生長繁殖而淘汰NOB［3］．本研究以經過厭氧－好氧（A／O）除磷工藝去除磷及大部分有機物的生活污水為對象，完成亞硝化（PN）反應器的啟動．待PN反應器穩定運行后，通過掃描電鏡（SEM）、熒光原位雜交（FISH）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）等技術，分析污泥微觀結構、解析功能菌群特性，探索功能菌群與反應器亞硝化效果之間的關系，為促進AOB富集、提高PN反應器效能提供理論基礎.

1實驗

1．1反應器裝置及進水水質反應器裝置為不銹鋼制的推流式反應器，后面接由有機玻璃制成的豎流式形式二沉池（圖1）．主體反應器規格為2．0m×0．6m×1．0m，總容積為1．2m3，分隔成4個相同大小的格室．通過設置導流孔防止流水返混，保持反應器連續流運行所需的推流條件．A／O除磷工藝的出水用作推流式反應器進水，進行亞硝化實驗．根據運行需要控制每個格室的曝氣量，通過單獨的氣體流量計檢測曝氣強度．二沉池總容積為300L，其中部分污泥進行回流，補充反應器污泥濃度．推流式亞硝化反應器接種600L某污水廠曝氣池末端的污泥（6650mg／L），硝化性能良好．實驗用水為實際生活污水，即北方某生活小區化糞池污水經過厭氧－好氧（A／O）除磷工藝去除大部分磷、COD、BOD，反應器進水水質如表1所示．按中國國家環保局頒布的標準方法測定進出水三氮質量濃度［4］：氨氮，納氏試劑光度法；亞硝酸鹽氮，N－（1－萘基）－乙二胺光度法；硝酸鹽氮，紫外分光光度法．溫度、pH及溶解氧采用WTW在線pH／DO檢測．

1．2掃描電鏡（SEM）觀察收集接種污泥及反應器啟動成功后的硝化污泥，進行掃描電鏡觀察微觀結構．方法如下：樣品加入磷酸鹽緩沖液（PBS，pH＝8．0）洗滌3次；加入體積分數為2．5％的戊二醛，于冰箱中4℃條件下固定2h；加入磷酸緩沖溶液（PBS，0．1mol／L，pH＝8．0）清洗10min；之后進行梯度酒精脫水，體積分數分別為30％、50％、70％、90％，再用無水乙醇脫水3次，每次10min；之后進行置換反應，即加入無水乙醇與乙酸異戊酯比為1∶1及純乙酸異戊酯各1次，每次15min；對樣品進行冷凍、真空干燥24h、噴金，通過掃描電鏡（HITACHIS－4300）觀察污泥微觀結構．

1．3熒光原位雜交（FISH）對接種污泥與硝化污泥進行熒光原位雜交分析，所用探針如表2所示，污泥樣品經過預處理、雜交、洗滌后進行觀察［5］．雜交過程所用探針雜交液組成為：體積分數20％～55％的甲酰胺，0．9mol／LNaCl，20mmol／LTris－HCl（pH＝7．2），質量分數0．01％的SDS；雜交后洗脫液組分為：56～225mmol／LNaCl，20mmol／LTris－HCl（pH＝7．2），10mmol／LEDTA，0．01％SDS．雜交后的玻片晾干后，通過熒光顯微鏡（BX51）及CellSensDimension軟件觀察，分析雜交結果．隨機捕捉20張FISH圖像，利用ImageProPlus6．0軟件分析AOB與NOB所占比例.

1．4變性梯度凝膠電泳（DGGE）及測序分析

1．4．1DNA提取與PCR擴增采用改進的氯仿－SDS方法提取硝化污泥微生物基因組DNA．取1g污泥，加入DNA提取液2．7mL（100mmol／LTris－HCl，100mmol／LEDTA，1．5mol／LNaCl，100mmol／LNa3PO3，質量分數為1％的CTAB，pH＝8．0）、蛋白酶K50μL（30mg／mL）、溶菌酶50μL（20mg／mL），混勻之后在37℃水浴、225r／min條件下震蕩30min；加入0．3mL質量分數為20％的SDS，65℃水浴2h時，期間每隔15min將樣品管輕搖混勻．水浴完成后將離心管取出，8000r／min條件下離心10min，棄沉淀；上清液加入等體積的氯仿／異戊醇（24∶1），混勻后離心10min（8000r／min）；上清液加入0．6倍體積的異丙醇，－20℃冷凍過夜，再在4℃、10000r／min條件下離心5min，去上清液，沉淀至通風處徹底晾干．加入100μLTE（100mmol／LTris－HCl，100mmol／LEDTA，pH＝8．0）溶解沉淀，－20℃保存備用［6］．采用通用引物GC－338F和907R擴增細菌16SrRNA基因［9］．PCR反應管內加入提取的基因組DNA1．0μL，dNTPs（2．5mmol／L）2．0μL，引物GC－338F和907R（20μmol／L）各0．5μL，10×Buffer2．5μL，ExTaq酶（5U／μL）0．125μL，加入無菌水至終體積25μL．采用TaKaRaTP600梯度PCR儀（日本）進行PCR反應，94℃開始變性5min；進入循環反應，包括94℃、40s，55℃、40s，72℃、1min3個步驟，共運行30個循環；72℃終延伸10min，4℃終止PCR反應．利用DNA純化回收試劑盒（天根，中國）對PCR產物純化回收，并通過瓊脂糖凝膠電泳驗證．

1．4．2DGGE及其結果分析DGGE電泳儀器為美國BioRad公司的DCodeSystem系統．通過加入尿素與甲酰胺配置質量分數30％～60％的變性梯度凝膠，配置質量分數為8％的聚丙烯酰胺凝膠進行PCR產物分析．DGGE操作條件為：電壓120V，電泳溫度與時間分別為60℃與8h，電泳緩沖液為1×TAE．電泳結束后，將凝膠清洗之后進行銀染［10］，在凝膠成像儀（BioRad）中通過軟件GelDocXR獲取銀染后圖像．1．4．3微生物系統發育分析通過銀染，DGGE凝膠出現明顯條帶，對這些條帶進行切割，將其溶于100μL1×TE（pH8．0）中，于4℃冰箱中過夜．以此為模板，相應不帶GC夾的338F與907R為引物，擴增細菌16SrRNA基因片段．PCR片段進行純化回收，通過T4DNA連接酶連接到載體pMD19－T（TaKaRa）上，42℃熱擊，轉化到感受態細胞EscherichiacoliDH5α（天根，中國）中．通過涂布平板，37℃過夜培養，構建目的基因克隆文庫．每個DGGE條帶的樣品選取3～5個陽性克隆送交上海生工生物公司進行測序．獲得的序列通過BLAST工具搜索相近序列，進行比對．將序列提交到GenBank，獲得基因登錄號為KF194203－KF194209．通過MEGA5．0軟件，以bootstrapNJ法構建相應序列的系統發育樹．

2結果與討論

2．1亞硝化反應器運行效果亞硝化反應器運行效果可用氨氧化率及亞硝化率來表征，其中氨氧化率（RA）計算方式.在之前的研究中已完成亞硝化反應器啟動［12］，過程如下：在A／O除磷反應器的出水中人工添加（NH4）2SO4至氨氮質量濃度為300mg／L（游離氨FA為11．36mg／L），溫度為室內自然溫度（16．4～25．5℃）．采用間歇操作方式，即經過進水（0．5h）、曝氣與沉淀（1h）、排水（1h）、閑置5個階段，對接種污泥進行馴化．對曝氣強度采用實時控制策略［13］，保持DO質量濃度0．2～0．8mg／L，避免延時曝氣．在這種工況下共運行了60個周期，出水NO2－－N與NH4＋－N比達1．0～1．30，亞硝化率一直保持90％以上，表明成功啟動亞硝化反應器．之后將進水氨氮質量濃度降到80mg／L，按SBR操作方式共運行40個周期，期間氨氧化率在90％左右，而亞硝化率一直在95％以上，說明反應器在低氨氮、間歇操作方式下，能保持亞硝化穩定運行［14］．此后，反應器轉變為常溫低氨氮連續流運行（本文實驗），進水流量（Qin）為125～160L／h，污泥回流量（Q回）為60～80L／h，水力停留時間（HRT）為7～9h．調節反應器4個格室的曝氣強度，分別為4～8L／min、3～4L／min、0（只進行缺氧攪拌）、3～5L／min，保持反應器溶解氧（DO）質量濃度處于較低水平（0．1～0．6mg／L）．整個80d運行期間，反應器氨氧化率、亞硝化率和出水NO2－－N與NH4＋－N比如圖2所示．由圖2可知，平均氨氮氧化率穩定在55％，亞硝化率接近100％，出水NO2－－N與NH4＋－N比穩定在1．11附近，可為后續ANAMMOX反應提供穩定水質．PN反應器亞硝化效果良好，推測AOB得到有效富集，NOB活性受到抑制．以此常溫低氨氮亞硝化反應器為對象，分析其功能菌群特性．

2．2亞硝化污泥微觀結構已有研究發現，Nitrosomonas類AOB數量較多時能使污泥顏色變黃，這主要是此菌體富含細胞色素所致［15］．亞硝化反應器在啟動過程中，就出現污泥顏色變化，由接種時淺黑色逐漸轉變成淺黃色，可推測Nitrosomonas類AOB數量逐漸增多．通過掃描電鏡，對接種污泥與亞硝化污泥進行微觀結構對比分析，結果如圖3所示．亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）和亞硝化球菌屬（Nitrosococcus）是在污水生物脫氮處理過程中經常出現的AOB菌屬，形態分別為短桿狀或球狀，而NOB主要為硝化桿菌屬（Nitrobacter）與硝化螺菌屬（Nitrospira），對應形態分別為桿狀或螺旋狀．由圖3（a）可知，接種污泥中微生物種類較多，有桿狀菌、短桿菌和球形菌（黑色線圈標注）；而在亞硝化污泥中（圖3（b）），短桿菌、球形細菌較多（黑色線圈標注）．郭建華等［16］曾經分析了短程硝化過程中種群結構的演變，SEM結果發現，接種污泥中含有桿菌、短桿菌、球形菌以及絲狀菌等多種形態微生物，而隨著短程硝化的啟動與穩定，污泥中短桿菌和球菌數量增多，成為優勢菌群，本實驗亦有類似變化趨勢．為進一步了解反應器內AOB與NOB豐度，開展污泥的熒光原位雜交（FISH）實驗，分析AOB與NOB的相對比例關系．

2．3反應器功能菌群FISH分析PN反應器啟動成功后，亞硝化率接近100％，可推測AOB為優勢菌群，NOB得到有效抑制．SEM結果也表明污泥微生物菌群結構發生了變化，但這都不能直接說明污泥中AOB或NOB數量的多寡．因此，對接種污泥與亞硝化污泥微生物進行FISH檢測，對其中AOB與NOB分布及相對比例進行定量考察．選取代表性AOB、NOB熒光照片及真細菌熒光照片，通過ImageProPlus6．0軟件進行分析，結果如圖4所示．圖4（a）和（c）中亮點部分代表AOB（Nitrosomonas）的分布，暗色部分為真細菌．同理，圖4（b）和（d）中亮度高的部分代表NOB（Nitrobacter）的分布，顏色較暗部分為真細菌．對FISH結果統計發現，接種污泥中NitrosomonasAOB與NitrobacterNOB的相對比例分別為35％和21％，說明AOB與NOB均是其中優勢菌屬，原因是接種污泥是從全程硝化反硝化脫氮污水處理廠中取樣．本實驗中，亞硝化污泥中NitrosomonasAOB相對比例略有升高，為37．3％，而NitrobacterNOB相對比例下降明顯，僅為4．4％，這表明反應器中AOB成為優勢菌群，而NOB逐漸淘汰．之前有研究發現，實時控制的SBR小型反應器短程硝化運行135d后，AOB數量占絕對優勢，NOB得到抑制與淘洗［16］．Sinha等［17］利用FISH方法，分析了連續流系統中短程硝化前后的污泥菌群比例，發現隨著反應器短程硝化的運行，AOB所占比例從接種污泥的2％～3％上升至短程硝化污泥的48％～53％，NOB比例較低，為6％～8％．這些研究表明，反應器在不同運行方式及不同控制參數影響下，AOB及NOB種群結構會發生明顯變化．本實驗中反應器在連續流運行時間內，AOB為優勢菌群，NOB活性得到有效抑制，數量較少.2．4微生物群落結構解析以亞硝化污泥為對象，通過提取基因組DNA、GC338F／907R引物擴增16SrDNA基因、DGGE等步驟，分析微生物群落組成；對DGGE條帶切膠、PCR、克隆測序，獲得的序列進行系統發育分析，結果如圖5所示．由圖5（a）可知，主要有6類優勢菌群存在PN反應器內，其中條帶3測序結果與Nitrosomonassp．（HF678378）相似度為96％，表明此類氨氧化菌為PN反應器內功能菌，負責維持亞硝化過程穩定運行．條帶1測序結果與Blastochlorissp．（AJ401203）相似度為96％．Blastochlorissp．為芽生綠菌屬細菌，革蘭氏染色為陰性，形態有桿形或卵圓形，異養厭氧生長或者微好氧生長．條帶2與Pseudomonassp．（HE603527）同源性最高，相似度為99％．Pseudomonassp．為假單胞菌屬，為常見的反硝化細菌，此類細菌的存在能夠消耗一部分有機物，這可能與進水中含有少量COD相適應．而條帶4與綠彎菌門細菌Chloroflexibacterium（EU875524）相似度為90％，該類細菌為常見的絲狀菌，常在生物脫氮除磷系統中出現［18］，可在活性污泥形成中起到骨架作用，有利于菌膠團的形成．條帶5與α變形綱的食羧寡養菌Oligotrophacarboxidovorans（AB099660）同源性最高，相似度為99％，該菌種也是活性污泥中常見的微生物［19］．而條帶6與δ變形綱的侏囊菌屬細菌Nannocystisaggregans（AJ233945）相似度為95％，后者屬于粘細菌的一種［20］，該類菌為革蘭氏陰性菌，屬于好氧化能有機營養型細菌，難以獲得純培養．綜上，PN反應器主要以自養型Nitrosomonassp．功能微生物為主，負責氨氧化過程；此外還存在一些異養菌，如Pseudomonassp．、Chloroflexibacterium及Blastochlorissp．．這些異養菌的存在并沒有影響反應器亞硝化效果，推測原因是進水中有機物很少（COD小于50mg／L，BOD5小于15mg／L），異養菌不能大量繁殖.

3結論

第8篇：微生物的純培養步驟范文

關鍵詞：釩；抗性微生物；篩選

中圖分類號：X53 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1073-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.05.011

Abstract： 21 strains of microorganisms with vanadium-resistance were screened from the surface soil at ZhuJiaBaoBao V-Ti-bearing magnetite， Panzhihua. The results of sequencing 16S rRNA gene showed that these bacterial strains were belonged to Actinobacteridae， α-proteobacteria， β-proteobacteria and γ-proteobacteria， respectively. It will provide a theoretical and experimental supports for future exploitation of microbial resource in vanadium-polluted area and bioremediation of the vanadium mine area.

Key words： vanadium； metal-resistant microorganism； screening

釩鈦磁鐵礦是含有鐵、釩、鈦、鉻等多種重金屬的共生礦，有很高的綜合利用價值。中國67.56%的釩資源來自釩鈦磁鐵礦[1]。釩的冶煉和釩合金的冶煉是環境中釩污染的重要來源。釩作為人體必需的微量元素具有多方面的生理作用，然而釩同時具有多方面的毒性和危害性。據文獻報道金屬釩毒性很低，但釩化合物對人及動物有中度或高度毒性[2]。其毒性作用與釩的價態、溶解度、攝取的途徑等有關，價態越高，毒性越大[3]。除明顯的急性中毒外，釩對人體尚有生殖毒性、胚胎毒性，可能還有致突變、致畸、致癌等毒性[4，5]。

基于微生物對重金屬的積累和解毒作用，近年來以凈化有毒金屬污染為目的的生物修復技術正在興起。微生物修復技術因其處理費用低、效率高、對環境影響小等優點，越來越受到廣泛的關注[6-9]。

在過去的幾十年里，國內外一些研究機構已在釩的生物效應及其環境地球化學行為等方面開展了大量研究工作，取得了一系列的成果[10-12]。這些研究成果是確定釩的環境行為，客觀評價釩的生物可利用性和毒理性不可缺少的基礎數據，也為人們有效地控制釩污染提供了科學依據。但有關釩污染生物修復方面的報道并不多見。

四川省攀枝花市朱家包包釩鈦磁鐵礦區位于攀枝花蘭家火山礦區東部，在該礦開采期間，產生大量粉塵、廢水和廢渣，這些廢棄物中含有大量的釩，通過揚塵、雨水沖刷等途徑擴散到周圍環境中，致使與該礦毗鄰的水資源、農田土壤受到嚴重的重金屬污染。為此，希望通過篩選一批重金屬釩的抗性細菌，為礦區釩污染的生態修復提供菌種儲備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

試驗土樣采自四川省攀枝花朱家包包釩鈦磁鐵礦區，采集表層（0～20 cm）土壤。土壤pH 8.03，土壤有機質含量為2.52±0.04 g/kg。土壤中V、Cr、Pb、Ni、Zn全量采用HF-HNO3-HClO4消煮，原子吸收法 （PerkinElmer AAS800，美國）進行測定[13]（表1）。

1.1.2 土樣的預處理 土樣置于無菌條件下的超凈工作臺中，經過濾后的空氣風干，過篩。用于篩菌的土樣過10目篩后裝于采樣瓶中，4 ℃下保存備用。采樣瓶和篩子需用紫外進行滅菌預處理。

1.1.3 培養基和試劑 無機鹽液態培養基（1 L）：硫酸鈉 2 g，磷酸氫二鉀 6 g，磷酸二氫鉀 5.5 g，氯化鉀 2 g，七水合硫酸鎂 0.2 g，微量元素 1 mL。

無機鹽瓊脂培養基：硫酸鈉 2 g，磷酸氫二鉀 6 g，磷酸二氫鉀 5.5 g，氯化鉀 2 g，七水合硫酸鎂 0.2 g，微量元素 1 mL，瓊脂 2.5 g，蒸餾水 200 mL。

有機培養基：蛋白胨 2 g，牛肉膏 1 g，氯化鈉 2 g，瓊脂 2.5 g，蒸餾水 200 mL。

微量元素配方（1 L）：二水合乙二胺四乙酸二鈉 55.0 g，七水合硫酸鋅 3.93 g， 氯化鈣 5.5 g，一水合硫酸錳 4.32 g，七水合硫酸亞鐵 5.0 g，四水合鉬酸銨 1.1 g，五水合硫酸銅 1.57 g，六水合氯化鈷 1.61 g， pH 7.0。

重金屬釩的加入，分別用濃度為1 000 mg/L的硫酸氧釩和偏釩酸鈉標準溶液稀釋得到所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離純化 分別稱取1 g土樣加入到100 mL的含重金屬釩濃度分別為10、30、60、100、200 mg/L的無機鹽培養基中，對抗性菌種進行馴化。于28 ℃條件下，將混有土樣的無機鹽液體培養基置于搖床上培養，轉速設定為150 r/min。培養14 d后，吸取5～10 mL原培養液轉接到新的液體培養基中，繼續恒溫搖床培養14 d。

連續轉接馴化4～5次，對馴化后的菌液進行稀釋涂布，取10-3和10-4的稀釋液各100 μL分別于含4價和5價重金屬濃度為10、30、60、100、200 mg/L的無機鹽培養平板上涂布培養，不同濃度梯度各做一組平行。

采用同樣的方法將菌液涂布于有機培養平板上進行培養。

培養一段時間后，根據出現菌落的形態特征做好標記，用接種環挑取單菌落，以劃線法接種到新的培養平板中[14]，用封口膜封口，置于28 ℃恒溫培養箱中培養。重復上述操作，直至獲得純培養。

1.2.2 DNA的提取 試驗采用加入蛋白酶K的方法使細菌細胞裂解。核酸抽提使用的是TIANGEN公司生產的細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）。按照說明書上的使用步驟進行操作。得到的DNA于4 ℃條件下保存。

1.2.3 釩抗性細菌的16s rRNA基因序列分析 對供試菌體進行16s rRNA基因PCR擴增[15]。正向引物27F序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R序列為5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。 PCR反應體系（25 μL）：細菌基因組DNA模板 1 μL，引物27F 0.5 μL，引物1492R 0.5 μL，ExTaq聚合酶體系12.5 μL，去離子水 10.5 μL。PCR反應條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，29個循環；72 ℃ 7 min。將PCR產物送于上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。

將測序公司反饋回來的測序結果，運用DNAMAN軟件將兩端引物以外的序列去除，余下的序列提交到模式菌種庫進行比對。將菌株序列及其相似度最高的模式菌種序列用DNAMAN軟件構建系統發育樹并進行16S rRNA基因同源性分析，發育樹的構型和穩定性用DNAMAN軟件取樣分析1 000次，進行Bootstrap值分析和評價。

2 結果與分析

2.1 序列分析

從有機培養基中篩選出11株菌，其中9株屬于變形菌門，2株屬于放線菌門。其中，4價釩培養基中篩選到的菌株全部為變形菌門，而2株屬于放線菌門的細菌均從5價釩培養基篩選得到（表2）。有機培養基中篩選出的優勢菌大部分為伯克氏菌屬。從無機培養基中篩選出10株菌，其中5株屬于變形菌門，5株屬于放線菌門，4價釩和5價釩培養基中篩選到的兩類菌各占一半。而其中的IV4_2、IV5_4和IV5_5與模式菌的相似度達100%。所有這21株釩抗性細菌中，7株屬于放線菌門，占全部菌株的33%；14株屬于變形菌門，占全部菌株的67%，屬于優勢菌群。菌種的門類結構見圖1。

鄭曉丹等[16]從16株抗汞細菌中篩選得到1株有較強抗重金屬鎘能力的細菌，屬于γ-變形菌綱氣單孢菌目。盛下放等[17]從不同來源的土壤樣品中篩選得到的2株鎘抗性細菌分屬于γ-變形菌綱假單孢菌目和芽孢桿菌綱芽孢桿菌目。耿印印等[18]從鎘含量超標的土壤中分離得到的14株鎘抗性細菌中，變形菌占總數的85.7%，屬于優勢菌群。卞光凱等[19]從江蘇南通沿海灘涂耐鹽植物的內生細菌中篩選得到的23株重金屬抗性細菌分別屬于變形菌門和厚壁菌門。由此可見，重金屬抗性微生物在群落結構上有其相似的地方，可以作為后續研究的重點方向。

2.2 系統發育樹分析

系統發育樹分析表明，釩抗性菌可分為4個類群：放線菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱。其中，IV4_2、IV5_4和IV5_5的親緣關系較近，均與模式菌Pimelobacter simplex（KCTC 9106）處在同一分支下，都屬于放線菌綱。而IV4_3、IV5_3、OV5_6和OV5_7也屬于放線菌綱。IV5_1和IV5_2的親緣關系較近，均與模式菌Methylopila capsulate IM1處在同一分支下，都屬于α-變形菌綱。而IV4_1、IV4_4和IV5_6也屬于α-變形菌綱。OV4_2、OV4_3、OV4_4、OV5_2、OV5_3、OV5_4和V5_5的親緣關系較近，均與模式菌Burkholderia fungorum （LMG 16225）處在同一分支下，都屬于β-變形菌綱。而OV4_1和OV5_1的親緣關系較近，均與模式菌Pseudomonas otitidis （MCC10330）處在同一分支下，都屬于γ-變形菌綱（圖2）。

3 小結與討論

微生物作為人類最寶貴、最具開發潛力的資源寶庫，種類繁多、分布廣泛，具有繁殖迅速、個體微小、比表面積大、對環境適應能力強等特點。在受重金屬污染的生態環境中，微生物產生各種變化以適應重金屬的脅迫。篩選耐重金屬細菌的一般途徑是在培養基中加入特定的金屬，再逐步提高該重金屬濃度的馴化條件下，經多代傳種而獲得目的菌株。

本研究從攀枝花市朱家包包釩鈦磁鐵礦區邊坡的土壤樣品中篩選到21株細菌。經試驗證實，從含低濃度重金屬釩的培養基平板中篩選出來的細菌都可以在200 mg/L釩離子濃度條件下生長，表明這21株細菌均可以耐受較高濃度的重金屬釩。

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第9篇：微生物的純培養步驟范文

重慶市銅梁區中醫院檢驗科 重慶市 402560

【摘　要】鏈球菌屬微生物在最初進行分類的時候囊括有40 多種類別，后來在人們進行更加細致的分類后，有些種類就被排除了。所以目前的鏈球菌屬被人們分成了6 個大群和30 個種類加上另外兩個獨立的類型。DNA 中的G+C 在鏈球菌所占的比例為34m0.1%-46m0.1%[1]。可以用來檢驗鏈球菌的學科有衛生微生物學和臨床微生物學。下文我們將細致的介紹檢驗方法。

關鍵詞 鏈球菌屬；臨床；檢驗；反應

1 臨床樣本的采集和處理

1.1 病原體標本

從患者身上及可能受污染的環境和衣物中采集標本，并用無菌試管進行保存在進行檢測。

1.2 臨床標本

收集血液、膿液、分泌物等進行送檢。

2 鏈球菌屬微生物的分類

因為該菌屬的種類十分多樣，目前我們臨床上大多都一直使用Lancefield 血清學的辦法來對該菌群進行分群（A、B、C、D、F、G 等18 個群），除此之外我們還可以通過它們是否能夠發生溶血的現象（溶血、溶血或草綠色溶血、溶血或不溶血）來進行大致的分類。臨床上最常見的就是化膿性鏈球菌，它屬于A 群且溶血的鏈球菌群[2]。

2.1 鏈球菌的形態與染色

革蘭陽性球菌，它的固體培養基之上會呈現出單個或者成雙的排列，很少會出現鏈狀式的排列，它在肉湯的培養基中會出現長鏈狀的排列，肺炎鏈球菌則會出現矛頭狀，成雙出現或者是鏈狀的排列。

2.2 培養特性

鏈球菌落在血瓊脂平板上可呈現出三種不同的溶血現象：1. 溶血的周圍出現灰綠色的狹窄的溶血環；2. 溶血的周圍有較大的完全透明的溶血環；3. 溶血（沒有溶血性）不發生任何溶血變化。肺炎鏈球菌的菌落是呈現中央有臍窩狀、表面十分光滑、呈灰色又較為扁平，而且四周還伴有草綠色的溶血環同時出現。

2.3 生化反應

觸酶試驗后出現陰性，對許多的碳水化合物的分解因為菌種的不同而有不一樣的反應，鏈球菌是不能夠被膽汁所溶解的。

肺炎鏈球菌的膽鹽溶菌的試驗會呈現出陽性反應。

2.4 鏈球菌的鑒別方法及要點

（1）菌屬自身特征：革蘭陽性球菌，呈現出單個、成雙或者是鏈狀的排列，菌落個體比較小，可以出現溶血、溶血或不溶血的現象，觸酶試驗的結果為陰性。

（2）通過個體是否發生溶血及其他關鍵性的試驗，對鏈球菌進行推測性的鑒定和大致分群。

A 群種類的鏈球菌（例如化膿性的鏈球菌）：出現溶血現象，對于桿菌肽敏感。

B群種類的鏈球菌（例如無乳鏈球菌）：菌落四周會出現溶血，在進行CAMP 試驗時，會呈陽性；馬尿酸鈉試驗時，也會呈陽性。

C 群種類的鏈球菌（例如獸疫鏈球菌和馬鏈球菌等）：使用馬尿酸鈉、6.5% 氯化鈉耐鹽對其試驗都會呈現為陰性。

D 群種類的腸球菌（例如糞腸球菌、鳥腸球菌等）：使用膽汁七葉苷、6.5% 氯化鈉耐鹽對其進行試驗均為陽性，可以在45℃生長。現這一類整體歸屬于腸球菌屬。

C、F 及G 群種類的鏈球菌都是使用最常見血清學方法來進行鑒別。

2.5 操作步驟

（1）涂片、染色，對菌落的特征進行觀察，挑取可疑的菌落，再次涂片染色鏡檢。

（2）觸酶試驗，根據《觸酶試驗標準操作規程》進行操作。

（3）鑒定，隨機的從血瓊脂平板上提取出純菌落，使用微生物的鑒定儀或傳統生化反應對細菌進行細致的鑒定和深入的分析。

3 檢驗結果解釋與分析

（1）草綠色的鏈球菌是在人體內的正常菌群之一，正常情況下是不會使人患病的，只有當草綠色的鏈球菌在血液等無菌體液中出現的時候，進行鑒定才有意義。

（2）如果通過檢測，發現鏈球菌對青霉素十分敏感，鏈球菌霉素o 對于氧氣相對敏感，而且它的抗原性特別強。同時該菌群有被認為對許多抗生素例如阿莫西林、頭孢克洛、頭孢唑林等頭孢類藥物極其敏感，則不需要再次進行上述的抗生素的藥敏試驗。如果通過檢測發現，肺炎鏈球菌菌落的苯唑西林抑菌圈大于或等于19mm，就應該對其進行青霉素、頭孢噻肟和頭孢曲松的MIC 檢測，因為者可能會出現青霉素的耐藥或中介現象。如果通過檢測，發現鏈球菌對紅霉素敏感或者有耐藥行，則說明該菌對克拉霉素、阿奇霉素、地紅霉素敏感或者有耐藥行。近年來因為對病原體和病菌對于抗生素例如青霉素、阿司匹林等產生了較強的抗藥性，所以給我們對于病人的臨床治療帶來了極大的困難。乙型鏈球菌它們對于青霉素、紅霉素、四環素、桿菌肽和磺胺藥等治療性藥物都特別的敏感，所以人們應該針對其各類特性研制出針對它們的藥物或治療手段。

4 臨床意義

化膿性鏈球菌（A 群鏈球菌）它是造成人體出現化膿性感染的最主要病原菌中的一個，它的使人發病的能力也是所有鏈球菌中最強，它可以引起人們出現癰、蜂窩織炎、急性咽炎、丹毒、膿皰瘡、猩紅熱、醫源性傷口感染和產后感染等。而且感染了這類鏈球菌之后，也有可能引發生急、慢性風濕熱和急性腎小球腎炎等嚴重的變態反應性并發癥。無乳鏈球菌（B群鏈球菌）正常情況下他寄居于婦女陰道和人體腸道內，它的帶菌率可達到30% 左右，這種菌會引起新生兒的感染。肺炎鏈球菌則寄生在健康人群的口腔、鼻咽部位，雖然它們屬正常菌群，但是也會會引起人們的急性肺炎或者是支氣管炎草綠色鏈球菌是人體上呼吸道正常菌群，通常不致病。

參考文獻