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【關(guān)鍵詞】農(nóng)田;重金屬污染;生物修復(fù)
0 前言
近年來,我國食品安全形式非常嚴峻,有一部分原因就是農(nóng)田遭到污染,尤其是重金屬污染。據(jù)報道,目前我國受砷、鉻、鉛等重金屬污染的耕地而積近2000萬平方千米,約占總耕地而積的20%;其中工業(yè)“三廢”污染耕地1000萬平方千米,污水灌溉達330多萬平方千米。重金屬不能被土壤微生物所分解,易在土壤中蓄積或轉(zhuǎn)化為毒性更大的化合物。土壤重金屬污染的特點為長期累積效應(yīng)、隱蔽性、不可逆性和一定的交互作用。土壤受重金屬污染后,影響農(nóng)作物并通過食物鏈等影響人體健康,造成中毒危害。另據(jù)國土資源部的最新調(diào)查顯示:每年我國約有1200萬噸糧食被重金屬所污染,這些糧食足夠養(yǎng)活4000萬左右的人口,并且這種污染問題日益嚴重。因此,對農(nóng)田重金屬污染的治理顯得尤為迫切。當(dāng)前,土壤重金屬污染的治理方法主要有工程措施、物理化學(xué)方法、化學(xué)修復(fù)方法、以及生物修復(fù)方法。本文將重點介紹生物修復(fù)法在農(nóng)田重金屬污染治理中的研究進展,同時對生物修復(fù)法治理農(nóng)田重金屬污染的研究前景進行展望。
1 簡介
生物修復(fù)法是指利用生物的生命代謝活動降低環(huán)境中有毒有害物質(zhì)的濃度或使其完全無害,從而使污染的土壤局部地或完全地恢復(fù)到原始狀態(tài)。其優(yōu)點有:成本低、不破壞土壤生態(tài)環(huán)境、可以回收再利用貴金屬、造成二次污染機會較少。缺點有:周期長、一種植物一般只能提取一種或者幾種重金屬、而植物固定只是將重金屬暫時固定,如果土壤環(huán)境發(fā)生變化,重金屬的毒性作用還有可能再次出現(xiàn)[1]。
2 生物修復(fù)法的分類
生物修復(fù)作用治理農(nóng)田重金屬污染方法可以分為動物修復(fù)法、植物修復(fù)法以及微生物修復(fù)法。它們有著不同的優(yōu)缺點。因此,在利用生物技術(shù)處理重金屬污染時,要結(jié)合當(dāng)?shù)貙嶋H,因地制宜,才能達到預(yù)期效果。
2.1 動物修復(fù)
動物修復(fù)是指土壤動物群通過直接的吸收、轉(zhuǎn)化和分解或間接的改善土壤理化性質(zhì),提高土壤肥力,促進植物和微生物的生長等作用而修復(fù)土壤污染的過程。有關(guān)動物修復(fù)的研究報道較少,主要集中在有機物和農(nóng)藥污染土壤的修復(fù)(如利用蚯蚓等修復(fù))和富營養(yǎng)化水體的修復(fù)(如利用濾食性貝類、棘皮動物、河蟹等修復(fù)),對重金屬污染土壤的動物修復(fù)機理仍處于探索階段[2]。
2.2 微生物修復(fù)
利用土壤微生物的蓄積和降解作用來治理土壤重金屬污染是一種高效的途徑。國內(nèi)外許多研究己證明,菌根在修復(fù)遭受重金屬污染的土壤方面發(fā)揮著特殊的作用,他們減輕了植物在重金屬污染的土壤中的受害程度[3]。
土壤重金屬污染的微生物修復(fù)是利用微生物的生物活性對重金屬的親和吸附或轉(zhuǎn)化為低毒產(chǎn)物,從而降低重金屬的污染程度[4]。利用微生物(藻類、細菌和酵母等)來減輕或消除重金屬污染,雖然微生物不能降解和破壞重金屬,但是可以通過改變它們的物理或化學(xué)特性而影響金屬在環(huán)境中的遷移和轉(zhuǎn)化。其修復(fù)機理包括表面生物大分子吸收轉(zhuǎn)運、細胞代謝、空泡吞飲、生物吸附和氧化還原反應(yīng)等。微生物對上壤中重金屬活性的影響主要體現(xiàn)在以下幾個方面:①溶解和沉淀作用;②生物吸附和富集作用;③氧化還原作用。微生物修復(fù)技術(shù)種類繁多,可進行異位修復(fù)、原位修復(fù)以及原位/異位聯(lián)合修復(fù)。其中,原位修復(fù)操作簡單,對原有的土壤環(huán)境破壞程度低。微生物修復(fù)受各種環(huán)境因素的影響較大,氧氣、pH、溫度、水分等均可影響微生物活性進而影響修復(fù)效果,其田間試驗效果不是非常理想。因此,為降解菌提供適宜條件以促進其生長繁殖至關(guān)重要,這也是今后研究的重點。
2.3 植物修復(fù)
植物修復(fù)技術(shù)是指通過植物自身及共存微生物體系,修復(fù)和消除由無機廢棄物和有機毒物造成的土壤環(huán)境污染的一種技術(shù)。
我國野生植物資源豐富,生長在天然的污染環(huán)境中的耐重金屬植物和野生超積累植物數(shù)不勝數(shù)。因此開發(fā)與利用這些野生植物資源對植物修復(fù)的意義十分重大。有關(guān)資料表明,大量植物對重金屬Cr,Cd,Co,Pb,Ni,Cu,Zn等有很強的吸收積累能力。比如國內(nèi)有人利用白菜修復(fù)重金屬污染土壤,如叢孚奇等將白菜用于鑰礦區(qū)重金屬污染土壤的修復(fù)研究,結(jié)果表明磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖溶液能顯著提高白菜的地上部富集土壤中重金屬元素的能力。李玉雙[5]等以沈陽張士灌區(qū)重金屬污染上壤為修復(fù)對象,采用盆栽試驗,研究了乙二胺四乙酸(EDTA)對白菜富集重金屬及其生長狀況的影響。結(jié)果表明,EDTA能夠提高白菜對上壤中Cu,Cd,Pd 和Zn的植物提取效率。
但是,由于超富集植物一般只能積累某些重金屬元素,植物物種的選取受到不同地理氣候條件的限制,同時富集植物和超富集植物生物量一般較少,生長速度慢,積累效率低。所以,利用野生抗性植物進行重金屬污染土壤的治理還未取得理想結(jié)果。這就需要相關(guān)科研人員做進一步深入的研究,以求早日獲得生長周期短,能吸附多種重金屬,積累效率高的重金屬富集吸收植物。
2.4 綜合修復(fù)技術(shù)
由于每個地區(qū)的污染物來源不同造成各地污染情況有很大的差異。只用一種修復(fù)技術(shù)往很難達到目標(biāo)。因此,開發(fā)復(fù)合修復(fù)方法成為土壤重金屬污染修復(fù)的主要研究方向[6]。現(xiàn)今開始投入應(yīng)用的復(fù)合修復(fù)技術(shù)的主要類型有動物/植物聯(lián)合修復(fù)、化學(xué)/物化一生物聯(lián)合修復(fù)以及植物/微生物聯(lián)合修復(fù)。
3 展望
生物修復(fù)技術(shù)治理重金屬污染土壤以其低成本、高效率、適用范圍廣和無二次污染等優(yōu)點已成為重金屬污染農(nóng)田土壤治理中的一個全新研究領(lǐng)域和國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者研究的熱點之一。但是由于其起步晚,難度大,其大部分研究還處于實驗室階段,尚不能有效地應(yīng)用于重金屬農(nóng)田污染的治理中去,但隨著不同學(xué)科(遺傳學(xué)、土壤學(xué)、生態(tài)學(xué)、化學(xué)、生理學(xué)、環(huán)境保護學(xué)和生物工程)的相互配合。我們相信該技術(shù)會日趨成熟,并且為重金屬污染農(nóng)田的治理貢獻出巨大的力量。
【參考文獻】
[1]肖鵬飛,等.土壤重金屬污染及其植物修復(fù)研究[J].遼寧大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2004,31(3):279-283.
[2]李宇飛.土壤重金屬污染的生物修復(fù)技術(shù)[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2001.34(12H):148-151.
[3]王真輝.農(nóng)田土壤重金屬污染及其生物修復(fù)技術(shù)[J].海南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2002,12:386-387.
[4]閻曉明,何金柱.重金屬污染上壤的微生物修復(fù)機理及研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,30(6):877-879,883.
隨著生物技術(shù)的發(fā)展,多肽類藥物在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛,相應(yīng)的制劑學(xué)研究也日益受到重視。與傳統(tǒng)小分子有機藥物相比,多肽具有穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短和生物膜透過性差等特點。在我國,重組人生長激素主要用于兒童內(nèi)源性生長激素缺乏引起的矮小癥、Turner綜合癥、成人GHD、燒傷及創(chuàng)傷的修復(fù)等治療。隨著臨床研究的深入,其在抗衰老、骨質(zhì)疏松和心血管疾病的治療方面亦顯示有很好的療效。近年來,重組人生長激素相關(guān)研究已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點之一,研究范圍從工程菌培養(yǎng)、生產(chǎn)、發(fā)酵、純化、凍干,一直延伸到制劑的改良和穩(wěn)定性提高等。本文就重組人生長激素的穩(wěn)定性研究進展作一綜述。
1 人生長激素的結(jié)構(gòu)特性和生理作用
人生長激素(hGH)是由腦垂體前葉分泌的一種單一肽鏈的蛋白質(zhì)激素,含191個氨基酸殘基,分子量為22 KDa,有兩個二硫鍵,無糖基化,是人出生后促生長的最重要激素,有很強的種屬特異性。hGH是一種具有廣泛生理功能的生長調(diào)節(jié)劑,能影響幾乎所有的組織類型和細胞,甚至包括免疫組織、腦組織及造血系統(tǒng),其主要作用是刺激骨、軟骨細胞的生長和分化,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、糖及脂肪的代謝。hGH發(fā)揮功能作用主要經(jīng)由兩個途徑:一是誘導(dǎo)肝細胞、肌細胞產(chǎn)生生長激素介質(zhì)(somatomedin,SM),再經(jīng)由SM間接起作用;二是直接作用于靶細胞產(chǎn)生生理效應(yīng)。無論何種途徑,hGH都需要首先同細胞表面特異性受體結(jié)合,再由受體介導(dǎo),激發(fā)一系列生化反應(yīng)并最終產(chǎn)生生物效應(yīng)。hGH的基本功能是刺激所有機體組織的發(fā)育,增加體細胞的大小與數(shù)量,hGH的這種促進細胞增殖作用的基礎(chǔ)是促進合成代謝。
2 引起重組人生長激素不穩(wěn)定的因素及其物理、化學(xué)不穩(wěn)定性
重組人生長激素(rhGH)是一種不穩(wěn)定的蛋白藥物,暴露在生理環(huán)境中或與有機溶劑接觸易發(fā)生聚集,形成可溶性和不溶性的蛋白聚集體。一些物理因素如劇烈攪拌、冷凍干燥和射線輻照等也都會加速rhGH聚集。溫度和pH值是影響rhGH穩(wěn)定性的最重要的因素。由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,很難總結(jié)出溫度對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能影響的普遍機理。一般來說,溫度越高,穩(wěn)定性越差。蛋白質(zhì)和多肽都是兩性電解質(zhì),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于極端pH值時,分子間靜電排斥增加,引起蛋白質(zhì)折疊,這一過程會導(dǎo)致電荷密度降低,即降低靜電自由能。極端的pH值會降低鹽橋(salt bridge)的形成能力,這也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低。此外,天然結(jié)構(gòu)與去折疊狀態(tài)內(nèi)帶電基團的pKa值不同,pH值的改變會影響帶電基團的性質(zhì),導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變。
多肽和蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性可以分為兩種情況,即物理不穩(wěn)定性和化學(xué)不穩(wěn)定性。最常見的物理不穩(wěn)定性是聚合。最常見的化學(xué)反應(yīng)包括以下幾種:1)脫酰胺反應(yīng)。在脫酰胺反應(yīng)中,Asn/Gin殘基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脫酰胺反應(yīng)與環(huán)境條件和多肽的結(jié)構(gòu)有關(guān),提高pH值、升高溫度都將有利于脫酰胺反應(yīng)的進行。2)氧化。多肽溶液易氧化的主要原因有兩種,一是溶液中有過氧化物的污染,二是多肽的自發(fā)氧化。在所有的氨基酸殘基中,Met、Cys和His、Trp和Tyr等最易氧化。氧分壓、溫度和緩沖溶液對氧化也都有影響。3)水解。多肽中的肽鍵易水解斷裂,由Asp參與形成的肽鍵比其它肽鍵更易斷裂。4)形成錯誤的二硫鍵。二硫鍵之間或二硫鍵與巰基之間發(fā)生交換可形成錯誤的二硫鍵,導(dǎo)致三級結(jié)構(gòu)改變和活性喪失。5)消旋。除Gly外,所有氨基酸殘基的(3C碳原子都是手性的,易在堿催化下發(fā)生消旋反應(yīng)。6)β消除。β消除是指氨基酸殘基中β碳原子上基團的消除。Cys、Set、Thr、Phe和TYr等殘基都可通過消除降解。在堿性pH下易發(fā)生B消除,溫度和金屬離子對其也有影響。
3 提高重組人生長激素穩(wěn)定性的途徑
3.1 化學(xué)修飾
目前研究最多的是聚乙二醇(PEG)修飾。PEG是一種水溶性高分子化合物,在體內(nèi)可降解,無毒。PEG與多肽結(jié)合后能提高熱穩(wěn)定性,抵抗蛋白酶的降解,降低抗原性,延長體內(nèi)半衰期。選擇合適的修飾方法和控制修飾程度可保持或提高原生物活性。通過高效液相色譜法(HPLC)可對修飾結(jié)果進行評價。
3.2 使用添加劑
穩(wěn)定蛋白質(zhì)類藥物常加入的輔料有糖類、多元醇、表面活性劑、鹽、氨基酸和大分子化合物等。糖和多元醇在低濃度下迫使更多的水分子圍繞在蛋白質(zhì)周圍,從而提高多肽的穩(wěn)定性;表面活性劑可降低蛋白質(zhì)溶液的表面張力,抑制蛋白質(zhì)在疏水性表面的聚集、沉淀和吸附或阻止蛋白質(zhì)的化學(xué)降解;鹽類可以起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用,也可以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,這主要取決于鹽的種類、濃度、離子相互作用的性質(zhì)及蛋白質(zhì)的電荷;一些氨基酸單獨或與其它輔料并用,通過優(yōu)先排除機制穩(wěn)定蛋白質(zhì),在凍干過程中,上述物質(zhì)還可以取代水而與多肽形成氫鍵來穩(wěn)定多肽的天然構(gòu)象,而且還可以提高凍干制品的玻璃化溫度;大分子化合物穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用機制可能包括大分子的表面活性、優(yōu)先排除、蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用的空間隱蔽度提高、限制蛋白質(zhì)運動及優(yōu)先吸附等。白蛋白(HSA)是穩(wěn)定蛋白質(zhì)常用的大分子物質(zhì),羥丙基β-環(huán)糊精(HP-p-CD)也是較有前途的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。
此外,一些二價金屬離子如鈣、鎂、鋅和鈷等通過配位作用容易與蛋白質(zhì)結(jié)合,使整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加緊實和穩(wěn)定,從而使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。使用不同的測試手段,如熱力學(xué)法和凝膠法可測試金屬離子和生長激素的結(jié)合部位。生長激素中的組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基可能是生長激素中的金屬結(jié)合位點。關(guān)于金屬離子對生長激素的影響可采用多種方法從不同角度去測量,如用差熱法去檢測鈣離子對重組人生長激素的影響,用熱穩(wěn)定性檢測鎂離子對于生長激素的作用,測試鈷離子的金屬鍵對生長激素的影響”等。結(jié)果表明,金屬離子確實使生長激素的穩(wěn)定性有所提高,但是其反應(yīng)的機理和過程尚不明確,而且,對于測量方法也沒有最佳的評價方法,每個方法都有各自的優(yōu)缺點。
3.3 其它
多肽發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)如脫酰胺、消除和水解等都需要水參與,水含量降低還可使多肽的變性溫度升高,因此,使用凍干技術(shù)可提高多肽的穩(wěn)定性。此外,通過使用生物降解材料,如聚乙交酯-丙交酯、乳酸羥基乙酸共聚物等制備重組人生長激素微球可達到較好的釋放效果并提高其穩(wěn)定性。通過基因工程手段替換引起多肽不穩(wěn)定的殘基或引入能增加多肽穩(wěn)定性的殘基可提高多肽的穩(wěn)定性。
4 重組人生長激素的分析檢測
rhGH屬于多肽類藥物的一種,其檢測方法與多肽類藥物相同。常用方法主要有高效液相色譜(HPLC)、
毛細管電泳(HPCE)、質(zhì)譜、凝膠電泳等法。檢測目的主要包括等電點測定(CIEF技術(shù))、分子量測定(SDS―PAGE和SDS―CGE)、穩(wěn)定性研究(HPCE輔以基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜法)、氨基酸組成分析(Edman酶解、化學(xué)降解法或直接多肽特異酶解后經(jīng)HPCE和HPLC分離進入氨基酸自動分析儀進行序列測定)以及結(jié)構(gòu)分析(質(zhì)譜、核磁共振、傅立葉紅外轉(zhuǎn)換光譜、圓二柱色譜)等。
4.1 高效液相色譜
HPLC法是檢測多肽組分含量、純度最常用和最成熟的一種方法。其中,反相色譜柱對多肽類藥物的分析占高效液相色譜分析的80%以上。
4.2 毛細管電泳
HPCE主要用于多肽純度的鑒定。與HPLC法相比,HPCE具有更高的分辨率和靈敏度,某些純化的多肽在凝膠電泳和HPLC上鑒定純度為100%,但用HPCE分析純度僅90%。同時,HPCE法的進樣量也更少。
4.3 DSC熱差分析儀
使用熱差分析儀可對蛋白質(zhì)藥物的熱穩(wěn)定性進行分析。
4.4 快原子轟擊質(zhì)譜
快原子轟擊質(zhì)譜是準(zhǔn)確測定多肽物質(zhì)分子量的有效方法。由于不易獲得碎片峰,其在測定多肽順序上有困難,應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜可解決這一問題。通過快原子轟擊質(zhì)譜確定多肽分子量,在此基礎(chǔ)上通過活化碰撞(CA)技術(shù)可對氨基酸序列進行識別。
4.5 電噴霧電離質(zhì)譜
電噴霧電離質(zhì)譜依靠強電場使分子電離。電噴霧技術(shù)與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用,不僅能測定生物分子的分子量,而且能確定多肽和蛋白質(zhì)的序列信息。
4.6 基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)
基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)具有操作簡單、靈敏度高、質(zhì)量分辨率高和測定質(zhì)量范圍寬等特點,非常適合生物分子和高聚物的分子量測定。
4.7 核磁共振
核磁共振(NMR)可用于確定氨基酸序列,并可對混合物中的各組分含量進行分析。