分子生物學研究精選(九篇)

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第1篇：分子生物學研究范文

關鍵詞：羊草；分子生物學；遺傳多樣性；組織培養；基因克隆

中圖分類號：S543.901　文獻標識碼：A　文章編號：1007-7847(2007)04-0289-06

羊草(Leymus chinensis)是多年生禾本科賴草屬草本植物，由于其環境適應性較強。具有耐寒、耐旱、耐鹽堿等優點而成為松嫩平原的優勢物種，同時羊草也是一種重要的牧草資源，蛋白質含量高，適口性好，耐踐踏，在發展草原畜牧業方面具有重大的經濟和社會效益，但羊草種子發芽率低、種子萌發最適pH值為8.0～8.5，加上過變放牧和草地鹽堿化日益加重等原因，我國現存系統管理重點實驗室項目(K09M6)羊草草地約有90％以上發生了不同程度的退化，因此，研究羊草的遺傳分化、抗逆機理、栽培育種以及轉基因等對于改善生態環境和草場建設具有重要意義，隨著分子生物學對各個學科的交叉滲透，使羊草的研究從細胞水平進一步深入到分子水平，羊草屬于異交植物，物種趨向于在種群中具有較高水平的變異性，僅在松嫩草原中西部靠近內蒙古高原東部草原上的羊草種群就數以千計，這為研究羊草種群的遺傳多樣性提供了對象，培養愈傷組織是進行羊草轉基因研究的前期工作，但誘導率低的問題尚未得到解決，筆者結合自己的科研工作，對羊草分子生物學領域的研究成果加以綜述，旨為羊草抗逆分子機理研究提供參考資料。

1　羊草遺傳多樣性研究

由于羊草生態適應性強、分布范圍廣、生境類型多樣，在長期的適應和進化過程中，羊草種群之間在形態、生理、生態以及遺傳特征方面均產生了趨異，RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態DNA)技術可以在對被檢對象無任何分子生物學資料的情況下對其基因組進行分析，而且具有費用較低、方便易行、模板DNA用量少、不需要同位素，在安全性和實驗操作上具有比AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴增酶切片段多態性)、SSR(simple sequence rc-peat，微衛星重復序列)等分子標記更加簡便易行等優點，從而使其成為目前研究羊草遺傳多樣性的最重要的手段之一，該技術主要是利用各種群羊草的總基因組DNA作為模版，篩選能夠擴增出具有明顯差異性條帶的隨機引物，以至少兩次重復均出現的結果做0，1矩陣圖，即有條帶記為1，無條帶記為0，計算總片段數及多態位點百分率、各種群間遺傳相似系數和遺傳距離，利用分析軟件進行聚類分析從而得到其遺傳結構樹狀圖，

羊草RAPD分析可以用于研究羊草的種群關系以及遺傳分化的影響因子，崔繼哲等應用RAPD技術證明相似生境或同一地域的種群在一些位點上表現出相似或相同的變化，劉惠芬等運用RAPD技術對內蒙古典型草原不同生境8個羊草種群進行分析，聚類結果顯示生境相似的種群能夠聚在一起，而地理距離最近的種群不一定歸為一類，說明小范圍內羊草種群間的遺傳分化與地理距離不存在相關性，而與其生境間的相似度相關，影響遺傳相似性的不是單一因子而是各種因子的綜合作用，較小地理范圍內羊草種群間的遺傳分化主要是由環境的異質性所引起的，筆者曾以采自中國大安堿地生態試驗站(N45°36′，E123°53′)的羊草種子單株播種栽培，以每株羊草幼苗的地上部為材料進行RAPD分析，30個實驗樣品的平均遺傳距離為0.1909，共可分為4個類群(待發表)，通過RAPD分析，還可以進一步將羊草遺傳分化多樣性的原因具體化，汪恩華等””利用分子標記與形態標記以21個有效隨機引物中對9份羊草材料進行RAPD分析，對隨機抽取的17份禾草種質進行了種質評估的比較研究，結果表明，羊草種質的小穗數、種子千粒重、葉色、有性繁殖量和結實率5個形態學指標與遺傳多樣性指標存在一定的相關性，應用RAPD技術對不同生境羊草在水分脅迫下游離脯氨酸含量的變化做聚類圖比較分析，證實水分是影響羊草種群間遺傳變異和生態型分化的一個最主要的因子，雖然水因子是影響羊草分化的一個主導因子，但是在實際研究工作中也認識到羊草變異和分化是多種生態因子綜合起作用的結果(如溫度、海拔、經緯度、土壤類型等)，而且各因子之間又是相互影響，在不同的生境中限制因子又是變換的，這就造成不同地理種群的羊草遺傳分化過程的復雜性，由此可見，目前以羊草為實驗材料的RAPD分析雖有許多報道。但是由于羊草本身具有較高的種群變異性。組成羊草群落的植物總計有357種，加之尚缺乏一種統一的標準分型方法，因此RAPD技術就成為研究羊草分類及來源的主要工具，在物種鑒定及遺傳分化研究中發揮著重要作用。

除了RAPD技術以外，等位酶技術也可用于羊草遺傳多樣性分析，等位酶是指由一個位點的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型，其功能相同但氨基酸序列不同，崔繼哲等通過該技術，綜合分析了松嫩平原11個羊草種群的遺傳多樣性及遺傳分化指標，深入剖析了灰綠型和黃綠型兩種葉色類型羊草種群之間的遺傳差異，證明種群間的遺傳距離與地理距離之間沒有相關，崔繼哲等還采用淀粉凝膠電泳技術，應用等位酶分析方法測定了松嫩平原南部微生境下羊草灰綠色和黃綠色兩種生態型9個種群的遺傳多樣性和遺傳分化程度，證明羊草種、種群和生態型水平都維持較高的遺傳多樣性，兩種生態型之間有明顯的遺傳多樣性差異及遺傳分化，另外，對不同生境、不同分類種群的遺傳結構分析發現羊草種群遺傳變異度很高，但是無論如何歸屬，松嫩草原上的羊草種群遺傳分化程度很低，推測可能與羊草為異花授粉、不同類型混生及種群間基因流強度大有關，劉杰等曾用SSR作為探針構建了羊草的遺傳指紋圖譜，為羊草種質資源評價、種間及種內親源關系分析、生物多樣性研究提供了有效手段，利用AFLP方法對我國不同地區分布的羊草材料進行的DNA多態性分析結果也表明了羊草基因組DNA具有比較豐富的多態性。

2 羊草愈傷組織培養及利用

植物組織細胞培養(plant tissue and cell cul-ture)是通過運用植物組織細胞培養技術實現植物育種獲得新品種的一條快捷途徑，既可以通過

花粉培養、未授粉子房以及胚株培養等誘導形成單倍體植物，也可以通過植物愈傷組織培養中普遍存在的染色體變異實現植物突變育種，另外，通過植物組織培養技術進行的植物細胞融合(尤其是原生質體融合)、胚胎培養以及植物體外受精技術可獲得遠緣雜交種，通過植物組織培養中的莖尖培養能夠產生無病毒原種，因而可用于植物脫毒，解決生產實踐中植物病毒危害問題，組織培養是植物細胞工程學、遺傳學、植物生理學、生物化學與分子生物學研究的重要基礎，不僅用于快速繁殖。還用于單倍體育種、種質保存、生理學研究和基因轉化等領域。

早在上世紀80年代，高天舜就利用羊草根莖作為外植體進行愈傷組織的誘導和植株再生材料，目的是為了改良羊草的遺傳性狀，試圖通過組織培養途徑獲得羊草新類型，該研究采用當年生羊草根莖幼嫩部分的節間基部切段以及隔年生老根莖和當年生根莖的芍間中部、頂部切段作為外植體，消毒處理后接種于3種MS培養基中，先進行暗培養。待長出愈傷組織后轉入光照培養，誘導率平均在20％左右，分化率最高也只有24.2％，羊草幼穗和成熟種子也可作為誘導愈傷組織的外植體，劉公社等，以幼穗作為外植體，恒溫25℃條件下誘導愈傷組織，在加有1mg/L2，4-D MS培養基上繼代2次后，轉移到含1.0mg/L KT和0.5mg/NAA的MS培養基上分化培養得到再生芽，并在無激素的基本培養基上獲得了生根的試管苗，移栽到溫室后可正常生長，盡管從羊草葉片、幼穗和成熟胚在同樣培養條件下均能誘導出愈傷組織，但只有幼穗愈傷組織能夠繼續分化出再生植株，但分化率因基因型和外源激素的不同而不同，以成熟羊草種子為外植體誘導愈傷組織具有操作簡便、污染程度低、材料選擇直觀化的優點，且誘導率和幼苗分化率較高、幼苗健壯、生長勢好，崔秋華等采用3種培養基(MS、B5和8114)，3種2，4-D的濃度水平(1、2、4 mg/L)培養羊草幼嫩根莖和種子，結果表明，以種子作為外植體可獲得較高的愈傷組織誘導率(29.05％)，但目前對于最適激素濃度沒有統一結論，其范圍從1～4mg/L不等，對愈傷組織的誘導效果也未達到令人滿意的水平，仍需要深入研究。

在對羊草愈傷組織的應用方面，可以以羊草種子誘導出的愈傷組織為材料，用含有NaCl的培養基和含有NaHCO3與Na2CO3的混合鹽培養基進行培養，測定羊草愈傷組織的耐鹽性，結果表明羊草愈傷組織對NaCl最大耐受強度為180mmol/L；對NaHC03與Na2CO3的混合鹽的最大耐受強度為4mmol/L中性鹽(NaCl)與堿性鹽(NaHCO3與Na2CO3)對羊草愈傷組織的脅迫機制明顯不同，國內外對于愈傷組織的培養大多應用于轉基因，但在羊草方面進行的該項研究卻很少，劉公社將攜帶PAT基因的質粒通過基因槍法轉化羊草愈傷組織。然后在篩選培養基上進行培養，篩選抗性愈傷組織并轉接到分化培養基上，得到再生苗，然后接種到含有篩選劑的生根培養基上培養后得到轉基因羊草小苗，該研究已獲得耐除草劑的羊草新品種專利，曲同寶等用基因槍將BADH基因轉入由羊草成熟胚誘導出的胚性愈傷組織中，獲得了轉基因植株，經過PCR檢測證明外源基因已整合到羊草基因組中并得以表達，雖然轉入羊草的基因都可被檢測到已整合人羊草基因組中，而且也得到表達，但是對于轉基因羊草對周圍生態環境的影響還未見相關報道，篩選突變體是羊草愈傷組織的另一用途，陳暉等用組織培養方法篩選獲得羊草抗羥脯氨酸(HYP)變異系HR20-8，該變異系細胞內游離氨基酸和蛋白質組分氨基酸含量均發生了較大的變化，與供體對照比較，分別提高2.35倍和1.40倍，其中，游離脯氨酸和蛋白質組分脯氨酸分別提高6.6倍和3.0倍，且脯氨酸合成途徑必需的r-谷氨酸激酶的活性提高了2.5倍。

3 羊草酶蛋白類研究

蛋白質是生物體生命中的第一重要物質，是生理功能的執行者，是生命現象的直接體現者，同時能夠調控相關基因的表達，植物對抗非生物脅迫必然有蛋白質的參與，比如耐冷蛋白、熱休克蛋白、水通道蛋白、赤霉素信號傳導蛋白等，從羊草中檢測這些蛋白的含量以及克隆表達該蛋白的基因對于研究羊草耐逆分子機理和改善羊草品質都具有重要意義。

目前對于羊草酶蛋白的研究還遠遠不夠，主要有細胞色素氧化酶、過氧化物酶、脂酶同工酶等，其應用也僅局限于闡明羊草的遺傳分化，通過聚類分析可以研究羊草種群在不同地理及生態環境中羊草在分子水平上細胞色素氧化酶同工酶存在著種內分化，羊草在同工酶水平上的分化受多個環境因子的綜合影響，而且與羊草耐寒性能存在一定的內在聯系，張麗萍等對采自同一天然草地上葉片呈黃綠色、灰綠色兩種類型羊草的根、莖、葉的過氧化物同工酶、脂酶同工酶進行了分析比較，結果表明，兩種葉色羊草，其相同組織的過氧化物同工酶譜及脂酶同工酶譜基本一致，兩種羊草葉片呈現不同顏色只屬不同生態型，

磁場處理不僅可以促進羊草的生長。而且還能提高羊草的抗鹽堿性，磁場使羊草過氧化物酶(POD)活性提高，并且誘發了一條新的同工酶帶，張衛東等認為羊草自交不孕的原因是自交不親和。并利用禾本科植物自交不親和性有關的硫氧還蛋白(thsioredoxin)^基因設計的引物在羊草DNA中檢測到預期片段，說明硫氧還蛋白h基因可能與羊草的自交不親和性有關，該基因現已被克隆并能夠從GenBank中查到其序列。

研究羊草草原土壤酶的活性可以判斷土壤的肥力，土壤肥力水平接近則土壤酶的活性相似，土壤蛋白酶、脲酶、多酚氧化酶的活性與土壤有機碳、全氮呈顯著相關關系，可以反映土壤肥力水平高低，是評價土壤退化的重要指標。

4 羊草耐逆基因的分離與克隆

羊草具有耐寒、耐旱、耐鹽堿的特性，并且蛋白質含量較高，說明羊草在面對非生物脅迫時高效表達能夠適應、緩解或對抗相應逆境條件的物質，尤其是調控這些物質表達的酶類基因，據報道，羊草種子個體萌發期最大忍受pH范圍是9.14-9.53，對于NaCl可耐受的最大強度為600mmol/L，對于Na2C03可耐受的最大強度為175mmol/L，為了弄清這種適應機制的復雜性，通過大規模的cDNA克隆或者表達序列標簽(EST)的測序分離相關基因是非常重要的，Jin等采集自然生長的植物葉組織經過Na2CO3脅迫處理構建了cDNA文庫，并對其EST進行測序對比分析，推斷在羊草葉和根中各有39和31個非生物脅迫相關基因，這些EST資源將有助于對植物耐鹽堿分子基礎的深入研究和理解。

甜菜堿是在生物體內起著滲透保護作用最主要的細胞相溶性物質，編碼決定該物質合成的關鍵酶一甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因已經先后從多種生物體內得到克隆，并在多種植物中進行了遺傳轉化。已獲得了抗鹽、抗寒、耐旱能力得到較大程度提高的轉基因植株，某些植物體內的甜菜堿含量和BADH活性隨著土壤鹽堿化程度的加重而增加，因此推測甜菜堿可能與羊草耐鹽堿性有關，目前羊草中的部分BADH基因片段也已經被成功克隆。

5　問題與展望

第2篇：分子生物學研究范文

Abstract: The animal protects own one driving way to ambient temperature's adaptation, displays in the duplication and the expression pattern change of the cell and presents the new gene open and the new protein factor synthesis. The gene level, the protein level, the cell membrane level and so on three aspects has carried on the summary about the research survey of animal which adapts to the ambient temperature, and discussed the molecular biology mechanism as well as in evolution significance which animal adapts to the ambient temperature.

關鍵詞： 動物；溫度；基因；蛋白質；細胞膜

Key words: animal；temperature；gene；protein；cell membrane

中圖分類號：Q291文獻標識碼：A 文章編號：1006-4311（2011）25-0324-02

0 引言

動物的一切生命活動（生長、發育和生殖等）都是在一定的環境溫度中進行的。一般說來，變溫動物生長發育所要求的溫度條件在 6-36℃范圍內；恒溫動物由于自身有調節體溫的能力，對環境溫度的適應范圍廣些[1]。當環境溫度在最低和最適溫度之間時，動物體內的生理生化反應會隨著溫度的升高而加快，代謝活動加強，從而加快生長發育速度；當溫度高于最適溫度后，參與生理生化反應的酶系統受到影響，代謝活動受阻，勢必影響到動物正常的生長發育。環境溫度若超出動物所要求的范圍，動物的生命活動就會出現停滯；溫度過高或過低會導致動物體死亡[2]。近年來關于動物對外界環境溫度適應的分子生物學研究主要集中在基因水平、蛋白質水平和細胞膜水平三個方面。

1 基因水平上的溫度

動物對環境溫度的適應，會使自身的細胞內轉錄和表達模式發成變化，以適合環境的變化，此時它會出現新的基因開放和新蛋白因子的合成，這總的來說是動物對自身的一種保護方式。

外界環境溫度的改變可以誘導動物體內熱激蛋白家族基因的大量表達，從而調整動物有機體對外界環境溫度的適應。

盡管熱激蛋白家族基因序列保守，編碼序列變異較低，但是，由于目前動物種類逐漸增多，熱激蛋白基因序列和拷貝數等也在逐步顯示出不同的趨勢。

適應不同溫度的果蠅居群，其熱激蛋白70基因內存在兩個顯著的差異[4]，一個大的插入/缺失（indel）多態位點（56H8/122）和一個單核苷酸多態位點差異；對于來自澳大利亞東部不同緯度的11個居群，插入/缺失位點的頻率與緯度呈正相關，由于緯度與溫度最大（小）值和平均值呈負相關，提示溫度和熱值變化可能對Hsp70基因的這一變異頻率產生了影響，Anderson[5]等也發現黑腹果蠅3號染色體右臂上hsr-omega基因的8bp缺失作為一個遺傳標記與緯度及最高溫（最熱月）呈正相關，另一個3端重復的標記則多出現于溫帶群體中，與冷適應性相關。適應于較低緯度的Drosophila lummei有7個Hsp70基因拷貝，其熱脅迫抗性高于具有5個拷貝的Drosophila lummei，后者在分布上處于較高的緯度，提示Hsp70基因結構與果蠅的適應緯度有相關性[6]。

果蠅體內一個名為“DmDG”的基因活性一旦下降，果蠅就會“怕熱”，從而喜歡向溫度更低的地方轉移，其喜好的環境溫度要比正常情況下低5攝氏度[7]。“DmDG”基因可能與果蠅的代謝功能相關。這個基因活性下降后，果蠅體內能量代謝就會活躍，于是就會更喜歡低溫環境。動物體內利用基因調節溫度適應性的機制普遍存在，這可以使動物適應很大的溫度變化。

克隆斑潛蠅（Liriomyza sativae）3種小分子Hsp（Hsp19.5、Hsp20.8和Hsp21.7）和2種Hsp60（TCP1α，TCP1ζ），定量PCR分析表明，3種小分子Hsp均能被低溫所誘導表達，而且Hsp20.8對低溫更敏感，這意味著不同的小分子Hsp可能響應不同強度的低溫脅迫。6種Hsp基因（Hsp19.5、Hsp20.8、Hsp21.7、TCP1α、TCP1ζ和Hsp90）的相對表達量在不同生長發育階段差異顯著。總的表達趨勢是：小分子Hsp（Hsp19.5、Hsp20.8、Hsp21.7）在蛹期表達量最高，而大分子Hsp（TCP1α、TCP1ζ、Hsp90）的表達量則隨著生長發育而遞增[8]。這意味著除響應溫度脅迫外，熱激蛋白基因可能還在昆蟲的生長發育中起著一定的作用。

2 蛋白質水平上的溫度適應

熱激蛋白（Hsps）是生物適應環境溫度變化的一個重要媒介分子。受到熱脅迫刺激后，動物有機體對熱的脅迫抗性提高與熱激蛋白表達量普遍成正相關[9]。

熱激蛋白存在于所有動物細胞中，是動物受到應激原刺激后誘導產生的一組應激蛋白，與機體的應激關系密切，在進化上高度保守。對滯育的吉普賽蛾（Lymantria dispar）幼蟲給以37-41℃的熱激可以誘發合成7種Hsps（分子量分別為90，75，73，60，42，29和22ku），-10--20℃的冷休克導致其產生2種Hsps（90和75ku），當在25℃下恢復時另外又合成分子量29ku的熱激蛋白[10]。斑馬魚在熱脅迫（28-37℃）和冷脅迫（20-28℃）下的熱激蛋白表達模式存在差異，在熱脅迫條件下，Hsp70呈上調表達，而冷脅迫下Hsp70則顯穩定表達[11]。將新月魚的成纖維細胞系的培養溫度從28℃調節到37℃時誘導產生3種不同的熱休克蛋白[12]。

較緩和的高溫對B型煙粉虱Hsp70表達具有誘導作用，極端高溫會抑制Hsp70表達。在37-41℃范圍內，Hsp70的表達量隨著溫度的升高而升高，在41℃時達到最高峰；當溫度升高到43℃和45℃，B型煙粉虱Hsp70的表達量迅速降低。B型煙粉虱溫室種群體內的Hsp70表達量與溫室內的溫度有關：上午到中午隨著氣溫的升高，B型煙粉虱體內Hsp70表達量隨之上升；傍晚氣溫降低時，Hsp70表達量也隨之下降[13]。Kimura（1998）比較過3個果蠅近緣種熱休克蛋白基因的表達情況，發現在冷激條件下，亞熱帶低海拔種（Drosophila watanabe）誘導熱休克蛋白表達的閾溫度要比溫帶種（D．traurara）和亞熱帶高海拔種（D．trapezifrons）高，而亞熱帶低海拔種的耐寒性卻最低，說明在果蠅中熱休克蛋白基因表達和耐寒性呈負相關[14]。Sorensen et al（2001）研究果蠅（D．huzzatii）不同自然種群間HSP70基因表達后，發現在冷激下寒溫帶種群誘導熱休克蛋白基因表達的閾溫度要明顯低于熱帶種群[15]。

3 細胞膜水平上的溫度適應

在正常生理溫度下，細胞膜的主動運輸、酶的活性、胞外分泌等機能才能正常進行[16]。細胞的膜脂在不同溫度下具有不同的酰基鏈和鏈長度[16]。細胞膜化學成分改變可能是對溫度適應的最普遍模式[16]。低溫通過影響細胞膜的流動性而影響細胞正常的機能，對低溫的適應不可避免地會涉及到細胞膜化學成分的改變。膽固醇能夠促使細胞膜結構的有序化，從而增加細胞膜的流動性。魚類通過改變脂肪酸中不飽和成分含量和極性磷脂頭部組分，減少細胞膜中甾醇/磷脂比率來改變膜的流動性使魚類更加適應寒冷的外界環境[17]。通過對不同溫度適應下虹鱒魚（rainbow trout）的肝、腎、腮等組織細胞細胞膜中膽固醇（C）與磷脂（P）含量的研究發現，5℃適應組細胞膜的C/P 值顯著低于20℃適應組[3]。把魚體暴露于低溫下會導致的極性磷脂中非飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比例增高，有利于在低溫下維持細胞膜流動性，使魚體更能抵抗低溫損害[18]。低溫還誘導細胞脂肪酸氧化酶的生成，由于它可以提高細胞膜中不飽和脂肪酸的含量，從而提高了細胞膜在低溫條件下的流動性[19]。

在動物對溫度的適應過程中，動物細胞還通過膜上各種離子通道數量及分布的改變使細胞內離子的成分和濃度發生相應的改變。研究表明，在北極生活的兩種魚類：Trematomus bernacchii和Trematomus newnesi在適應較高溫度過程中，腮和腎等滲透壓調節器官細胞膜上的Na/K+-ATP酶活性升高，將細胞內鈉的、氯離子快速泵出體外，從而使得血清中滲透壓明顯降低，與海水間的滲透壓差增大。研究結果表明，在冷環境中，魚類靠升高體液離子濃度及滲透壓來縮小與外界海水之間的差異，從而減少能量損耗[3]。鴨子對冷適應表現為肌漿網或內質網上Ca2+-ATPase活性及Ca2+釋放通道數量上的改變時相與非寒顫產熱的發生相一致[20]。

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第3篇：分子生物學研究范文

關鍵詞：鉀離子通道；結構；基因

離子通道(ion channe1)是跨膜蛋白，每個蛋白分子能以高達l08個／秒的速度進行離子的被動跨膜運輸，離子在跨膜電化學勢梯度的作用下進行的運輸，不需要加入任何的自由能。一般來講，離子通道具有兩個顯著特征：

一是離子通道是門控的，即離子通道的活性由通道開或關兩種構象所調節，并通過開關應答相應的信號。根據門控機制，離子通道可分為電壓門控、配體門控、壓力激活離子通道。

二是通道對離子的選擇性，離子通道對被轉運離子的大小與電荷都有高度的選擇性。根據通道可通過的不同離子，可將離子通道分為鉀離子(potassium ion，k )通道、鈉離子(natrium ion，na )通道、鈣離子(calcium ion，ca2 )通道等。其中，k 通道是種類最多、家族最為多樣化的離子通道，根據其對電勢依賴性及離子流方向的不同，可把k 通道分為兩類：①內向整流型k 通道(inward rectifier k channel；kin)，② 外向整流型k 通道(outward rectifier khannel；k out)。k 是植物細胞中含量最為豐富的陽離子，也是植物生長發育所必需的唯一的一價陽離子，它在植物生長發育過程中起著重要的作用，具有重要的生理功能。植物中可能存在k 通道，這一點早在20世紀6o年代植物營養學界就有人提出，而一直到80年代才被schroeder等人[23證實，他們利用膜片鉗(patch chmp)技術，首先在蠶豆(v／c／afaba)的保衛細胞中檢測出了k 通道鉀離子通道的結構單個鉀離子通道是同源四聚體，4個亞基(subunit)對稱的圍成一個傳導離子的中央孔道(pore)，恰好讓單個k 通過。對于不同的家族，4"亞基有不同數目的跨膜鏈(membrane。span。ning element)組成。兩個跨膜鏈與它們之間的p回環(pore helix loop)是k 通道結構的標志2tm／p)，不同家族的k 通道都有這樣一個結目前從植物體中發現的k 通道幾乎全是電壓門控型的，如保衛細胞中的k 外向整流通道等，其結構模型如圖2一a所示。離子通透過程中離子的選擇性主要發生在狹窄的選擇性過濾器(selectivity filter)中(圖2一b)，x射線晶體學顯示選擇性過濾器長1．2 nill，孔徑約nill，k鉀離子通道的作用.有關k 通道在植物體內的作用研究并不多。

從目前的結果來看，認為主要是與k 吸收和細胞中的信號傳遞(尤其是保衛細胞)有關。小麥根細胞中過極化激活的選擇性內流k 通道的表觀平衡常數km值為8．8 mmol／l，與通常的低親和吸收系統km值相似[ 。近年來，大量k 通道基因的研究表明，k 通道是植物吸收轉運鉀離子的重要途徑之一。保衛細胞中氣孔的開閉與其液泡中的k 濃度有密切關系。質膜去極化激活的k 外向整流通道引起k 外流，胞質膨壓降低，導致氣孔的關閉。相反，質膜上h．atpase激活的超極化(hyperpolarization)促使內向整流鉀離子通道(k in)的打開，引起k 的內流，最終導致氣孔的張開鉀離子通道相關基因及其功能特征迄今，已從多種植物或同種植物的不同組織器官中分離得到多種k 通道基因(圖3)，根據對其結構功能和dna序列的分析，可以把它們分為5個大組：工，ⅱ，ⅳ組基因屬于內向整流型通道；m組屬于弱內向整流型通道(weakly inwardakt1arabidopsis k transporter 1)是第一個克隆到的植物k 通道基因，采用酵母雙突變體互補法從擬南芥cdna文庫中篩選出來cdna序列分析表明，akt1長2 649 bp，其中的閱讀框為2 517 bp，編碼838個氨基酸殘基組成的多肽，相對分子質量約為95 400 da。akt1編碼的k 通道，對k 有極高的選擇性，其選擇性依次是k >rb >>na >li 。

northern blot分析表明，akt1組織特異性較強，主要在根組織中表達zmk1(zea mays k channel 1)是從玉米胚芽鞘中分離出的k 通道基因，在皮層表達。在卵母細胞中的表達表明，zmk1編碼的k 通道是通過外部酸化激活的。有研究表明，藍光對zmk1通道在玉米胚芽鞘中的分布有一定影響[3 2l。1組kat1組基因編碼內向整流鉀離子通道，其與akt1組基因產物結構上的最大區別是在cooh端沒有錨蛋白相關區(枷n—related do—main，anky)。kat1組基因主要包括kat1，kst1，sirk，kzm1，kpt1等。kat1(arabidopsis inward rectifier k channel1)是與akt1同時從擬南芥cdna文庫中篩選出來的植物k 通道基因。kat1基因的閱讀框含有2 031個核苷酸，編碼的多肽由677個氨基酸殘基組成，相分子質量約為78 000 da。kat1的表達具有組織特異性，kat1在擬南芥植株中的主要表達部位是保衛細胞，在根和莖中也有少量的表達。人們認為kat1通道可能參與了氣孔開放，并向維管組織中轉運k ，而不是直接從土壤中吸收kj。

以kat1為探針，又能從擬南芥cdna文庫中篩選出kat2等功能類似的內向整流型k 通道基因通過基因工程技術，人們已相繼開展了將kati和akti基因導人到擬南芥、煙草和水稻的研究，并獲得了一些轉基因植株。比如，施衛明等利用根癌農桿菌介導法已成功地把kat1和akt1導人擬南芥和野生型煙草中，并獲得了轉基因植株及其純合株系，發現轉基因植株的吸鉀速率和對k 的累積能力都比對照的有明顯的提高，而且，經過分子檢測，也證實711和akt1基因在轉基因植株中得到了整合和表達。因此，運用現代分子生物學手段和基因工程技術篩選高效利用鉀的作物品種或利用現有的鉀離子通道基因改良作物品種，從而提高作物本身的鉀吸收利用能力應該是目前主要的研究方向。可以相信，隨著分子生物學技術、基因工程技術和有關分析測試技術的發展和應用。隨著研究工作的不斷深入，有關鉀離子通道基因的分離、克隆和利用會取得更大的進展。

參考文獻：

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第4篇：分子生物學研究范文

關鍵詞:研究生培養;分子生物學;實驗教學

分子生物學是從分子水平上研究生命現象、生命本質、生命活動及其規律的科學,是當前生命科學中發展最快并與其他學科交叉滲透最廣泛的前沿學科之一.進入21世紀,分子生物學的實驗技術與方法已經應用到了生物學各個分支學科的研究中[1].研究生教育是培養具有科學精神和創新能力高層次人才的主要方式,培養碩士研究生創新思維和科學研究能力,將是作為研究生階段的研究工作和將來作為科研人員所必備的素質.近年來,很多高校在研究生的培養上采取了重大舉措,如浙江大學、中國科技大學、西安交通大學、中國農業大學等,實現了研究生的理論教學、實驗教學和學位論文研究三階段的培養模式[2].在加強研究生理論教學和學位論文研究的同時,注重研究生實踐能力的培養,增加了實驗教學環節,實現研究生實踐能力的寬領域培養,再通過學位論文的研究,形成研究生實踐能力的立體全方位培養.作為一個生物學研究生,把本科所學的基礎知識與科學研究的最新進展聯系起來,學好、學通分子生物學是必需的一步.基于此,2012年起我校在生物學科研究生學位課中設置“分子生物學實驗”課,3年來雖然取得了明顯的成效,得到了研究生與指導教師的認可,但在實際運行過程中也發現了一些問題,還需要通過不斷的改革和實踐,使生物學科的研究生更系統、更全面地掌握分子生物學的實驗技術和技能,為后續的研究性實驗工作和今后走上工作崗位提高科研水平打好一個堅實的基礎.

1課程定位及理念

分子生物學在20世紀取得了理論和技術的飛速發展.分子生物學技術越來越廣泛地應用于生命科學的各個研究領域當中.隨著越來越多的理論突破,分子生物學技術也日新月異.在高等院校的生物相關學科的研究生教學中,越來越廣泛地注重分子生物學的教學.分子生物學理論課教學內容多,范圍廣,有一定深度,學生很難透徹理解和掌握,如果不做實驗,只學習理論,往往會事倍功半,理不出頭緒.分子生物學實驗課能給學生親自動手參與實驗全過程的機會,便于學生加深對相關理論的理解[3].研究生來自不同的院校,由于各院校課程設置不同,研究生接受的本科階段的教育差別很大,這種差別在實驗操作能力上體現最為明顯.對于已經進入分子時代的生命科學來說,不熟練分子生物學實驗操作的學生就很難快速適應課題研究的科研工作.在研究生學位課中設置分子生物學實驗課,合理安排實驗課內容,建立常規操作與科研課題相結合的實驗課程體系,是提升研究生實踐能力的重要途徑,同時也能為學生完成碩士學位論文及將來從事科研工作打下良好基礎.內蒙古科技大學生物學碩士研究生學位點于2006年經批準設立,2007年起招收首批碩士研究生,近10年來,已為及全國輸送了一批從事生物學研究與開發的優秀人才.“加強專業技術教學、緊跟學科發展前沿、全面提升研究生培養質量”一直是本學科研究生培養工作的重點和目標.為適應新形勢下高等院校研究生教育與創新型人才培養的目標,對研究生分子生物學教學的改革勢在必行.2012年以來,我們通過在研究生學位課中設置“分子生物學實驗”課,不僅顯著地提高了研究生對分子生物學課程的學習熱情,而且明顯提升了研究生的科研能力.

2課程建設及特色

2．1課程建設的過程與方法

每學年的秋學期初新錄取的研究生入學,根據對新生分子生物學知識背景和實驗動手能力的詳細調研合理安排實驗課內容,建立常規操作與科研課題相結合的實驗課程體系,并根據學科發展不斷更新和完善,力求促進研究生科研工作的順利開展.研究生分子生物學實驗教學的改革分為3個階段進行.

2．1．1準備階段

組織相關人員成立課題小組,對小組人員進行具體分工,以2015年新入學的碩士研究生為研究對象,采用問卷調查方式對他們的分子生物學基礎知識與實驗操作能力進行摸底,撰寫調查報告[4].

2．1．2實施階段

(1)制定教學大綱.根據準備階段的調查結果討論研究生分子生物學實驗課教學大綱,實驗項目實行多層次、模塊化管理,分為基礎性、綜合設計性、創新性3個模塊.基礎性實驗項目以基本的分子生物學操作技術為主,如:質粒DNA的提取、限制性內切酶酶切DNA分子、瓊脂糖凝膠電泳分離DN段、大腸桿菌感受態細胞的制備、重組DNA分子的構建與轉化等、PCR擴增目的基因等.對沒有任何分子生物學常規操作基礎的研究生要逐個開出;對本科階段已經接觸并熟悉這些基礎性實驗的研究生可直接開出綜合設計性實驗,如:多種方法獲得目的基因、動植物中某關鍵基因的克隆、重組質粒的構建等.創新性實驗項目全部由本學科教師承擔的科研課題轉化而來,研究生可根據自己的研究方向與興趣愛好選擇項目完成,包括植物細胞中MYB類轉錄因子的篩選、與人類遺傳病相關的核苷酸重復序列的克隆等.

(2)學生選課.將全部實驗教學內容及具體開出安排提前公布,學生根據實際情況與自己的研究方向進行實驗內容的選擇,這一環節須由指導教師協助完成.選課結束后根據每個項目的選課情況準備實驗,包括學生分組、準備實驗材料、儀器設備、耗材試劑和實驗講義與實驗報告冊分發等.

(3)預實驗.指導教師根據學生分組情況,每組安排組長一名,副組長一名,在實驗開出前協助指導教師完成預實驗.

(4)實驗課開出.按計劃認真組織研究生開出實驗.實驗操作階段,要求學生熟練掌握實驗操作流程,嚴格按規范進行操作.同時指導教師要充分調動學生的學習積極性和主動性,增強學生獨立完成實驗的能力和實際動手能力,使學生能夠盡可能主動地、獨立地完成實驗的整個過程,為以后獨立從事科研設計和科學實驗打下良好的基礎.

(5)課程考核.實驗課結束后進行成績考核,綜合學生的預習報告、實驗操作、實驗結果與實驗報告撰寫情況給出實驗課成績.

(6)編寫研究生實驗教材.基于教學實踐的積累,編寫研究生實驗教材“研究生現代分子生物學實驗”,重點面向研究生的實驗教學,將分子生物學基本實驗技術和近年來發展起來的新技術、新方法有機融合.

2．1．3總結階段

跟蹤調查,了解研究生在分子生物學實驗課結束進入課題研究后的情況,掌握他們在分子操作各個環節上的操作熟練程度,對取得的研究資料做全面的整理分析.在學科內部推出“研究生分子生物學實驗”示范課,并完成相應的資料庫與光盤制作,并進一步在全校范圍內推廣.同時課程改革小組的成員要不斷討論項目實施過程中存在的問題,并及時與兄弟院校溝通學習,提出切實可行的辦法[5].

2．2指導教師隊伍建設

自2012年生物學科碩士研究生開設分子生物學實驗課以來,該課程的教學任務一直由我校外聘的留美分子生物學專家王建英教授負責,另配2名講師作為助手.經過3年來的教學實踐體會,加上學生與研究生導師的意見反饋,我們發現這種單一的指導教師模式是需要改進的,需要建設一支由長期工作在科研、教學一線教師組成的研究生實驗課教學團隊.教學任務分配上,根據團隊內每位教師主要從事的科研領域和專業特長,分配相應的實驗教學內容,每個項目安排2名指導教師,他們不僅熟悉所指導實驗的技術要點,及時解決實驗過程中出現的各種問題,還能將本領域相關的科研前沿、熱點問題介紹給學生,以開闊學生視野,使每次實驗均能獲得預期結果.同時,指導教師在教學實踐過程中也不斷發現和審視自己,包括對自身專業知識的把握與實驗技能熟練程度的反思,這樣也能促使他們緊密跟蹤學科發展前沿不斷提高[6].本課程經各方面協調討論,現已逐漸組建了一支人員穩定、業務基礎全面、具有團結協作精神的教學團隊.其中教授3人、副教授2人、講師2人.其中大多數教師承擔國家自然科學基金、內蒙古自然科學基金、內蒙古高校基金等科研項目,在努力完成這些科研任務的同時,有意識地將許多科研工作中的思路和先進的技術轉化到研究生分子生物學實驗的教學實踐中.實驗課教學團隊的建設極大地提高了研究生實驗教學質量,并申請得到了我校研究生教學改革項目建設立項資助.

2．3實驗課成績考核與結果評價

經過教學團隊的調研討論,針對分子生物學實驗考核形式的問題,提出實驗課評價體系多層次評價的管理制度,包含預習報告、平時考勤、實驗操作、實驗結果與實驗報告撰寫情況5個部分,分別所占比例為1∶2∶4∶1∶2;針對設計性與創新性實驗,要加上實驗方案制定與實驗論文撰寫環節.針對研究生各實驗組人數較少、時間較靈活、學生專業多樣化等特點,在考核中更加注重實驗的具體操作過程.在課程開課初要將考核方案告知學生,讓他們明確各環節的評分標準,在實際考核過程中如實記錄作為評價依據.實驗課結束后,通過“問卷調查與后期跟蹤相結合”的模式及時對教學效果進行評價[7].通過發放問卷調查表的方式綜合調查研究生對本門實驗課的內容設置、教學方法及授課教師的教學效果等信息的評價.另外,在實驗課結束一個學期后,我們對研究生指導教師進行問卷調查,對上一年度的實驗教學效果進行了后期跟蹤評價,對研究生進入到各自實驗室工作后的科研思維、實驗設計、操作能力等進行調研,綜合評價實驗教學效果[8].

3結語

分子生物學實驗技術是生物學各分支學科科學研究必備的手段,在研究生入學后進入課題研究之前開設“分子生物學實驗”課,熟練掌握基本的分子生物學操作技術,這是生物學研究生快速進入科研課題與順利完成碩士學業的基本保證[9].研究生經過基本實驗技能培訓、全面綜合實驗及自主設計實驗的鍛煉及創新實驗平臺的全方位提升,科研能力得到大幅度提高.學生普遍反映研究生分子生物學實驗為他們順利進行課題研究、完成學位論文和未來的科研工作奠定了良好基礎,一部分學生在碩士期間就發表了高水平的SCI論文.為生物學研究生開設分子生物學綜合實驗,在內蒙區內外兄弟院校進行此類設置的尚不多見,需要我們更加努力創立并逐步完善研究生實驗教學平臺,全面提升我校碩士研究生培養水平[10G12],及時將教師的科研成果提煉引入實驗教學,提高指導教師的教學能力,使實驗內容不斷更新,為研究生進行課題研究及畢業以后從事相關的科研工作打下堅實的基礎.

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第5篇：分子生物學研究范文

病理性瘢痕包括增生性瘢痕(Hypertrophic Scar，HS)和瘢痕疙瘩(Keloid，K)，是因成纖維細胞增殖，生長失控、膠原過度沉積導致真皮纖維化。K表現為侵襲性瘤樣生長，而HS卻隨時間推移有自然軟化趨勢，可見在形成機制方面還有不同之處。雖然目前病理性瘢痕形成的機制還不太清楚，但這方面的研究卻方興未艾，本文就近年來對病理性瘢痕發生機制的研究綜述如下。

1　病理性瘢痕形成的機制研究

1．1　肌成纖維細胞在瘢痕形成中的作用：正常創面愈合過程中的創面收縮或過度愈合引起的病理性瘢痕以及各種纖維化疾病中，肌成纖維細胞(Myofibroblast，MFB)的作用越來越受到學者們的廣泛關注。MFB最主要的特征是胞質中出現完整的細胞骨架結構，包括微絲、微管系統。它除了表達胞漿肌動蛋白外，還可以與以下四種主要表型共同表達：①波型蛋白(vimentin)；②波型蛋白和結合蛋白(desmin)；③波型蛋白和a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)；④波型蛋白、結合蛋白和a-SMA。并且還證明MFB可以表達不同的平滑肌肌漿球蛋白重鏈(MHC)，表明MHC表型對進一步鑒別分化好的MFB不同表型意義較大。而a-SMA是體內MFB最常見的標志，其次是波型蛋白，因此可用a-SMA鑒定MFB。

在增生性瘢痕及纖維化病灶中，a-SMA陽性的MFB持續存在。免疫組化顯示a-SMA陽性的MFB主要存在于HS結節狀結構中，而K中則幾乎不存在MFB。因為瘢痕疙瘩的特性為幾乎不萎縮也不發生攣縮，內含粗大的膠原纖維，而增生性瘢痕則會發生萎縮也易攣縮，內含散亂的細膠原纖維，所以有理由認為瘢痕的攣縮與其中所含的MFB有關。另外，在證實了胎羊、胎鼠等在胎內前2／3的時間傷口不產生瘢痕，而到后1／3時間傷口會出現瘢痕愈合基礎上，Estes等通過透射電鏡及免疫組化方法研究了孕早期及孕晚期胎羊傷口MFB發生情況，發現孕75天制作的傷口中無a-SMA，而在100～120天制作的傷口中大量表達。電鏡下可見細胞中微絲逐漸增多、排列也漸規則，并發現伴有連接纖維形成，說明MFB在瘢痕形成過程中可能起到一定作用。

1．2　病理性瘢痕形成和細胞凋亡的關系：細胞凋亡為細胞的一種主動性細胞自殺行為。在生理情況下，細胞凋亡起到調節細胞數量、便于形態發生、去除有害或異常細胞、清除已完成功能的細胞等作用；在病理情況下，凋亡不足或過度，均可導致疾病發生。最近有研究證實，人體的系統性硬化疾病中，存在成纖維細胞的凋亡增加及細胞外基質的增加。通過電子顯微鏡與原位末端DN斷標記技術發現，肉芽組織向瘢痕組織轉變期間，隨著傷口的愈合，肌成纖維細胞和血管細胞的凋亡增加，并推測凋亡缺乏可能在病理性瘢痕的形成發展中發揮了重要作用。通過TUNEL及免疫組經技術發現，增生性瘢痕中存在細胞凋亡現象，增生性瘢痕消退過程中，成纖維細胞數量的減少與成纖維細胞的增加相一致。由此可認為，MFB凋亡不足和增加，是增生性瘢痕產生和消退的原因。Luo，Funayama等研究發現在瘢痕疙瘩組織中同時存在細胞增生、壞死和凋亡。Mcssadi等通過標記定量研究發現，正常皮膚成纖維細胞凋亡率比瘢痕疙瘩高2倍，凋亡相關基因表達也下降。Chen等通過基因芯片對8400條人基因研究檢測發現，普通瘢痕與瘢痕疙瘩相比，有402條基因的表達有區別，其中有250條基因上調，152條基因下調，有8種凋亡基因表達過低。由此推斷，瘢痕疙瘩不能正常凋亡并持續產生膠原，是其不斷增生的原因之一。

1．3　Bcl-2對病理性瘢痕的影響：病理性瘢痕均是以細胞增殖所致的疾病。Bcl-2是參與細胞增殖與凋亡的重要調節基因，對細胞凋亡具有直接抑制作用，并能促進細胞的存活。我們的調查表明：Bcl-2可促進成纖維細胞的增殖，抑制成纖維細胞的凋亡。減少凋亡，延長存活的作用，必然導致膠原蛋白合成沉積增多，從而促使皮膚纖維化發生。

1．4　氧自由基和病理性瘢痕的形成：氧自由基是體內各種代謝反應的中間產物，化學性質活躍，很容易與其他分子或自由基發生氧化還原反應，生成新的自由基，由此引發連鎖反應，它具有重要的生理功能，同時也與人體多種疾病密切相關。丙二醛(MDA)是自由基與生物膜中的多價不飽和脂肪酸作用發生脂質過氧化反應生成的終產物，它的產生與脂質過氧化平行，測定其含量不僅可反映脂質過氧化的程度，同時也間接反映了機體細胞損傷的程度。李偉人等通過測定病理性瘢痕中丙二醛的含量，發現增生性瘢痕與瘢痕疙瘩中丙二醛含量均較正常人皮膚明顯升高(ρ＜0．05)，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩比較無差異(ρ＞0．05)，表明在病理性瘢痕中脂質過氧化程度加重，局部組織細胞由于遭受自由基攻擊也可能發生了一定程度的損傷。而引起病理性瘢痕局部自由基產生和清除失衡的原因可能與生成增多有關。Wan等的研究也表明病理性瘢痕中與自由基生成有關的補體C3和游離鐵含量明顯高于正常皮膚。在成熟瘢痕中丙二醛含量與正常人皮膚比較無差異，則可能是因為自由基生成與清除已恢復平衡，從而脂質過氧化程度也趨于正常。同時我們也注意到，與成熟瘢痕相比增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中MDA含量非常顯著升高(ρ＜0．01)，提示通過減輕脂質過氧化程度可能有助于防治病理性瘢痕的形成。

2　瘢痕疙瘩形成機制的研究

K是繼發于皮膚損傷，如創傷、燒傷或手術后，以膠原過度沉積為特征的皮膚疾病。其形成機制的研究，目前在細胞、分子生物學及遺傳學方面比較活躍。

2．1　抗瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的研究：K組織中成纖維細胞(fibroblast，FB)過度增生，大量的細胞外基質沉積和向正常皮膚侵襲、生長從而形成K，其原因是瘢痕疙瘩成纖維細胞(Keloid derived fibroblast，KFB)凋亡受阻引起的。Saed等在所有KFB的p53exon4編碼72位點，檢測到精氨酸脯氦酸的置換，而HS和K患者正常皮膚等標本未發現異常，提示p53基因為KFB后天獲得性突變的高發區，并且該基因精氨酸／精氨酸純合型患者耳部K的發生率明顯增加，而脯氨酸／脯氨酸純合型患者發生HS的幾率增加。卓陽等認為，p53脯氨酸等位基因頻率的檢測，可作為K高危個體的判斷標志。魯峰在20％(2／10)的K標本中發現，fas exon9編碼區的“A”堿基的移碼突變，提示編碼fas“死亡區”結構基因的突變，可導致fas蛋白功能喪失和K細胞凋亡障礙。Bel-2、c-jun和c-fos原癌基因與FB的增殖有關。在增生期，HS和K的基底細胞、散在的FB樣細胞和血管周圍紡錘形細胞強烈表達Bcl-2，而c-jun和c-fos mRNA及其蛋白分子，則主要分布于真皮FB樣細胞和血管周圍細胞，

正常皮膚未見上述異常表現，推測活躍的KFB增殖與Bcl-2蛋白和c-jun、c-fos轉錄和翻譯水平增加有關。1999年有研究發現，K組織中有64種凋亡誘導相關基因表達下降。K基因表達的重新編程或真皮模式的病態分化，可能涉及K的發病機制，可作為K的病理診斷標志和治療策略。KFB凋亡普遍依賴caspase-9的活性作用。KFB凋亡相關基因表達的失衡，表面為轉化生長因子(Vansforming growth factor TGF)β1活化以及p53、fas及caspase-3、caspase-8、caspase-9表達缺失，表明KFB凋亡抗性基因位點位于caspases上游。

在K形成的過程中，局部生長因子非主要因素，起關鍵作用的是KFB對生長因子的敏感性，即通過上調KFB胞膜上生長因子受體的數量，提高外源性刺激信號的轉導能力和效率，是其細胞增殖和凋亡抑制的主要原因之一。IGF和TGF-β1，通過促纖維化效應和絲裂原效應，刺激FB增殖和瘢痕形成，是與KFB凋亡抗性關系密切的細胞生長因子。此外，腫瘤壞死因子-α在上調KFB抗凋亡能力中也發揮重要作用。

2．2　角質形成細胞的異常作用：表皮-真皮相互作用是近年來創傷修復研究的熱點。表皮角質形成細胞通過自分泌、旁分泌和內分泌作用，調節組織內環境穩定和細胞增殖、分化和凋亡。在增生期K和HS表皮-真皮交界區域Bcl-2陽性，FB增多，提示表皮-真皮之間的相互作用，參與了病理性瘢痕的形成。KFB凋亡障礙可能與K低氧環境有關，即K微血管閉塞和缺血缺氧環境能誘導KFB和血管內皮細胞等表達Tβ1和缺氧誘導因子-1。后者可誘導抗凋亡蛋白Bcl-2表達，并可經P13-激酶通路激活抗凋亡激酶(Akt／PKB)，以維持細胞的功能和低氧適應性。

2．3　瘢痕疙瘩與langerhans細胞：K及HS組織中S-100蛋白及Cala免疫反應陽性的Langerhans細胞明顯增多。Langerhans細胞與K形成關系密切。瘢痕過度增生的原因之一可能是由于病變部位Langerhans細胞增多，造成成纖維細胞過度合成膠原和細胞外基質，最終結果造成了膠原的過量沉積。HS臨床表現類似于K，兩者表皮組織中的Langerhans細胞均明顯多于正常皮膚，且無明顯差異，說明兩者在形成機制方面存在某些相同處。

2．4　瘢痕疙瘩與染色體2q23、7P11及易感基因：最近，Mameros等通過瘢痕日本家系和非洲裔美國人家系進行遺傳學研究后發現，日本家系與染色體2q23連鎖，非洲裔美國人家系與染色體7p11連鎖，他們還報道了一個有10人發病的非洲裔美國人中等大小的瘢痕疙瘩家系進行同樣的研究，卻未發現與2q23和7p11存在連鎖關系，說明瘢痕疙瘩易感基因位點存在異質性。雖然單個基因的突變可以導致對瘢痕疙瘩產生特異的易感性，但是不同人群瘢痕疙瘩的發病率不同，而且發病年齡、臨床表型和對人不同治療的反應，也存在差異，說明不僅是一對基因參與瘢痕疙瘩的發病。其發病機制可能是由于若干對微效基因(minor gene)。最近，張剛等采用比較基因組雜交方法檢測了6例瘢痕疙瘩患者的染色體后發現染色體1q、16q、20q和22q存在部分缺失，推測這種缺失導致抑制性基因的丟失，造成瘢痕疙瘩的發生和發展，從而認為瘢痕疙瘩的發病可能與染色體的結構畸變有關。

3　增生性瘢痕形成機制的研究

3．1　TGF-β3對增生性瘢痕形成的生物學作用：增生性瘢痕是現代外科治療難點，轉化生長因子β(TGF-β)在組織纖維化中具有重要作用，TGF-β是明顯的促瘢痕形成因子，而TGF-β3可減少TGF-β1、TGF-β2的產生，從而減少細胞外基質(ECM)合成，因此，TGF-β3，有可能是人體內在的抗瘢痕形成因子。TGF-β家族是細胞生長、分化、ECM合成與代謝的多功能調節因子。哺乳類動物TGF-β是三種異構體，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，而這三種異構體在體內分別具有不同的功能以維持平衡，這種平衡被打破將會導致組織器官纖維化。TGF-β1是具特征性的促纖維化形成因子，通過自分泌和旁分泌機理，刺激成纖維細胞產生膠原及其基質成分并沉積。Shah等對成纖維細胞體外培養研究發現，TGF-β1和TGF-β2中和抗體有明顯抑制成纖維細胞增殖，減少膠原蛋白等ECM合成，而無型別特異性的TGF-β多克隆抗體卻無此作用。因此認為纖維化疾病可能是TGF-β異構體表達失衡所致。

3．2　Smad2、Smad7與增生性瘢痕：Smads蛋白家族是近年來發現的轉化生長因子β1，受體下游信號蛋白，也是目前公認的介導TGF-13。胞內反應的主要通路。TGF-β1是與瘢痕形成最密切的細胞因子。Smads是TGF-β1的下游信號蛋白，Smad2和Smad7分別起正性和負性調節作用。已知在增生性瘢痕中TGF-βⅠ、Ⅱ型受體明顯增加。因此我們推測，Smad2信號通路在細胞內異常持續地激活和(或)smad7抑制作用逐漸減弱，是增生性瘢痕形成的原因。Smads在細胞核內的正確定位是信號轉導的前提。NSF組織有少量磷酸化Smad2表達且位于細胞質中；HSF組磷酸化Smad2表達量增多且位于細胞核中，表明其可持續激活靶基因轉錄，導致增生性瘢痕的形成。

3．3　增生性瘢痕相關蛋白p311：有學者曾利用基因芯片技術，對燒傷后同體早期HS與正常皮膚組織的差異表達基因進行篩選，找出97條相關基因并逐一分析，結果顯示p311(Genebank ID：hsu36189)基因表達差異顯著。同時，Pan等也報道了p311基因的編碼蛋白p311能夠促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，進而可能影響創傷修復甚至纖維化的發生發展過程。p311的編碼蛋白由68個氨基酸組成，相對分子質量為8×103。p311在細胞分化過程中可能扮演著轉錄因子轉錄活性的角色。目前之所以關注P311，一則是因為p311基因在早期的HS中呈高表達，另則是因為它能夠促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化。而肌成纖維細胞又是創傷不全愈合過程以及腫瘤間質反應中影響纖維化過程的重要靶細胞。這也暗示P311可能通過肌成纖維細胞影響創傷修復甚至纖維化與HS的發生發展過程。

3．4　組織缺氧與增生性瘢痕的關系：缺氧促使成纖維細胞合成大量的膠原，上調TGF-β的分泌，TGF-β能夠進一步促

進膠原的合成，大量膠原纖維的存在勢必導致氧彌散功能的下降；在創傷后早期肉芽組織內就有血管閉塞現象，在增生性瘢痕組織內可見大量閉塞、半閉塞性的毛細血管，與血管內壁增多的內皮細胞有關。缺氧導致膠原合成增加和血管閉塞，兩者進一步加重缺氧，反復循環，最終導致增生性瘢痕的形成，但持續的缺氧使膠原合成受限使瘢痕轉向成熟。用原位雜交技術對增生性瘢痕進行分析：成纖維細胞合成Ⅰ、Ⅲ膠原增加，尤其在靠近血管網的部位；TGF-β不但能為成纖維細胞而且能為血管內皮細胞所分泌。說明TGF-β能通過自分泌、旁分泌調節膠原的合成。增生期的增生性瘢痕的氧分壓是降低的，隨著瘢痕的成熟，組織氧分壓才逐漸接近正常組織水平，增生性瘢痕外觀顏色鮮紅，表現為血液供應豐富，這與組織低氧分壓表現并不一致，原因在于過度增生的膠原纖維結節阻礙了瘢痕組織的氧氣交換，也可能是瘢痕組織增生活躍氧耗增加，使瘢痕組織貌似血供豐富，其實處在缺氧狀態。

3．5　皮膚圓錐體結構損傷和增生性瘢痕：梁智等通過對雌性杜洛克豬(female red duroc pig，FRDP)的皮膚圓錐體結構損傷情況進行觀察，發現淺創面組FRDP皮膚圓錐體結構的上半部分受損，但脂肪穹隆以及腺體完好，可見圓點狀結構和均勻的出血點，愈合后無瘢痕形成。深創面組皮膚圓錐體結構的上半部分缺失、下半部分受損，傷及脂肪穹隆及腺體，未見圓點狀結構和均勻的出血點，愈合后有瘢痕形成。創面愈合及瘢痕形成情況：淺創面組創面在傷后3周內愈合，較為平整，無瘢痕組織形成；深創面組創面愈合時間在傷后4周以上，較厚、無毛發、攣縮、質地堅硬、局部色素變淺或加深。深創面組傷后10、30天皮膚的變化與淺創面組相似，成纖維細胞和炎性細胞主要存在于圓錐體結構周圍，脂肪穹隆逐漸變小，并被炎性細胞所填充；傷后150天愈合的創面明顯增厚，有明顯的瘢痕組織形成。深創面組傷后時間越長，瘢痕越厚；傷后150天瘢痕增生達高峰。圓錐體結構的深層部分受損可導致HS的產生。VVG染色計分顯示，不同深度創面在不同時相點形成瘢痕的規律是創面越深，瘢痕越厚。由此說明，皮膚圓錐體結構受損與HS的形成有一定關系。

第6篇：分子生物學研究范文

關鍵詞：豬傳染性胃腸炎；病毒分子；生物學檢測方法

中圖分類號 S858.28 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）12- 0110-02

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）導致豬出現脫水、水樣腹瀉以及嘔吐等為主要臨床癥狀的高度傳染性疾病，該病在春季、初秋以及冬季具有較高的發病率[1]。豬傳染性胃腸炎最早發生于美國，隨后在世界各地均有發生，我國于20世紀50年代首次發現該病，目前全國大部分地區均發生過豬傳染性胃腸炎。不同日齡和品種的豬均可以感染傳染性胃腸炎，其中以15日齡左右的仔豬發病后死亡率最高，高達100%；5周齡以上的仔豬感染傳染性胃腸炎后死亡率較低，但是會影響仔豬后期的生長，降低仔豬的飼料利用率。目前，該病已被世界動物衛生組織列為B類必檢傳染性疾病。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，該技術已經廣泛用于各種細菌性和病毒性疾病的檢測[2]。本文綜述了分子生物學技術在傳染性胃腸炎中的應用，以期能為從事傳染性胃腸炎診斷和防控的工作者提供幫助。

1 傳染性胃腸炎病毒基因組結構和基因表達方式

1.1 TGEV基因組結構 傳染性胃腸炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，該病毒的基因組不分節段、單股正股RNA，具有高度傳染性。傳染性胃腸炎基因組全序列分為7個區29kb，結構序列為5'-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3'，并且該基因組的3'-末端以共價鍵結合的poly結構，5'末端有帽結構[3]。基因組1約有20kb，主要負責病毒的編碼，其余基因均在近3'端。傳染性胃腸炎病毒全基因組編碼由4種結構蛋白和3種非結構蛋白組成，其中基因7、基因3和基因1為非結構蛋白，N、M、sM、S為傳染性胃腸炎的結構蛋白。

1.2 基因表達方式 傳染性胃腸炎病毒在胞漿脫殼以后，其正鏈RNA就呈現了mRNA的功能，使基因1轉錄表達RNA聚合酶，同時該基因有作為模板合成負鏈RNA，進而親代RNA與負鏈RNA形成雙鏈復制中間體。因此，在感染傳染性胃腸炎病毒的細胞內，可以檢測出不完全RNA、基因組RNA、mRNA以及雙鏈中間體4個特異性RNA，這可以作為豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學檢測指標之一[4]。

2 結構蛋白及功能

豬傳染性胃腸炎病毒的結構蛋白主要為S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是豬傳染性胃腸炎病毒纖突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，該蛋白基因全長4.3kb，蛋白分子量為195～220ku；S蛋白不僅是決定豬傳染性胃腸炎病毒抗原的重要結構，也影響著病毒對細胞的致病性、親嗜性等。M蛋白是構成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前體是由膜外區、信號肽、極性區、跨膜區突于病毒粒子內C-端區等功能區域構成，分子質量為29～31ku；M蛋白不僅決定了病毒粒子的出芽位點和裝配位點，也可以影響病毒變異。N蛋白是一種酸性蛋白質，分子量為47KDa，含有382個氨基酸殘基，該蛋白不僅是豬傳染性胃腸炎病毒的結構蛋白，同時對病毒基因組的加工、復制都具有重要作用。sM蛋白分子質量為78ku，含有1種小膜蛋白和82個氨基酸殘基，該功能蛋白在抗豬傳染性胃腸炎病毒感染的體液和細胞免疫中具有重要作用。

3 分子生物學檢測方法

3.1 核酸探針 核酸探針檢測方法的基本原理是利用核苷酸堿基互補，在堿基互補過程中，采用標記物標記與被檢測靶序列互補的單鏈核酸分子，進而檢測到目的核序列。該檢測方法與掃描電鏡、熒光抗體試驗、病毒分離等相比，具有較好的特異性，并且可以實現快速檢測的目的。現代研究表明[6]，不同的病毒探針可以分別擴增出與其對應的病毒模板，對其他病毒模板影響不大，同時核酸探針擴增的最低檢測限為3 000～6 000個拷貝的單個病毒核酸，具有較高的特異性和敏感性。

3.2 普通RT-PCR方法 該檢測方法使用的首要條件是知道被檢測病原的相關目的基因序列，根據相關目的序列后，采用相關軟件設計相應的引物，然后進行體外擴增目的基因，進而達到檢測的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法檢測豬傳染性胃腸炎病毒，并采用相同濃度做重復性檢測，結果顯示RT-PCR擴增的特異性條帶為590bp左右；然后又以豬瘟病毒、豬細小病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬病病毒以及豬輪狀病毒做特異性試驗，結果顯示僅有豬傳染性胃腸炎病毒得到了特異性目的條帶，所以RT-PCR檢測方法對豬傳染性胃腸炎病毒檢測具有較好的重復性和特異性。

3.3 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR檢測方法是以普通PCR為基礎發展的一種新型檢測方法，該檢測方法可以在一個PCR反應體系中加入多對引物，并通過采用優化后的PCR反應條件，達到同時檢測多種病原的目的，具有快速、成本低等優點，目前也常用于各種疾病的診斷。霍金耀等[8]建立了多重RT-PCR法檢測傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、嵴病毒和A群輪狀病毒的方法，并對該檢測方法進行了敏感性試驗和特異性試驗，結果顯示，多重RT-PCR法可以檢測出50TCID50的混合病毒，且能擴增出長度為275bp、544bp、750bp的3條特異性片段，具有較高的特異性和敏感性，可以在臨床上推廣使用。

3.4 套式PCR方法 套式PCR方法需要設計內、外2對引物，并通過2次擴增對樣品進行檢測，該方法相對其他PCR檢測方法，具有較高的敏感性，且節約成本。現代研究表明，PCR技術在檢測病毒時，可以省略不同病毒分離的過程，具有較高的敏感性和特異性，而套式PCR方法在病毒粒子較少的情況下依然能夠檢測出，表明套式PCR比常規PCR具有更好的敏感性。沈海娥等[9]采用套式PCR檢測豬呼吸道冠狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的S基因序列，根據兩組病毒的基因序列分別設計了2對引物，然后分別以豬呼吸道冠狀病毒細胞和豬傳染性胃腸炎病毒細胞為模板進行套式PCR特異性片段擴增，結果顯示，豬呼吸道冠狀病毒擴增的基因片段為214bp，豬傳染性胃腸炎病毒擴增的基因片段為886bp，同時檢測出了這種病毒，具有較高的特異性和敏感性。

3.5 熒光定量RT-PCR方法 熒光定量RT-PCR檢測方法的原理是在PCR反應體系中采用熒光探針標記法或加入了SYBR GreenI熒光染料標記PCR的反應產物，然后使用反應儀器收集反應產物的熒光信號，并根據熒光信號的強弱確定產物的量，進而達到與起始模板準確定量的目的。該檢測方法與常規RT-PCR相比，不需要進行電泳試驗檢測PCR反應產物，反應結果更為直觀、方便，同時又避免了因電泳試驗對環境造成污染。王建中等[10]根據豬傳染性胃腸炎病病毒的S基因序列設計了引物，并通過多組試驗對熒光定量RT-PCR反應條件進行優化，結果顯示，優化后的檢測方法對其他病原的檢測結果均為陰性，檢測結果的敏感性高達43.07拷貝/μL，是常規PCR檢測方法的100倍，具有較高的敏感性和特異性。

3.6 環介導等溫擴增技術 環介導等溫擴增技術是近幾年新興的一種分子生物學檢測方法，因其具有特異性強、敏感性高、檢測速度以及操作簡單等優點，目前已經廣泛應用于病毒病和細菌病檢測。高睿澤等[11]根據豬傳染性胃腸炎病毒的N基因建立了環介導等溫擴增快速檢測方法，并對該檢測方法的敏感性和特異性進行了評價，結果顯示，該方法在63℃下可以使豬傳染性胃腸炎病毒N基因獲得較高的特異性擴增，且與豬流行性腹瀉病毒等物交叉反應，具有加高的特異性；同時該檢測方法可以檢測到131.4fg/μL的DNA，其靈敏度比常規PCR高出3個數量級。

參考文獻

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第7篇：分子生物學研究范文

摘要 瑞氏木霉是自然界中普遍存在并有重要經濟意義的一種絲狀真菌，作為工業生產菌株生產多種水解酶類已有多年歷史。本文報道了用基因工程手段對瑞氏木霉進行遺傳改造，構造具新性狀的重組菌株，用以過量產生同源和異源蛋白類物質的分子生物學研究進展。包括利用CBHI基因的強啟動子在瑞氏木霉中過量表達瑞氏木霉內切葡聚糖酶、小牛凝乳蛋白酶、人抗體片段、哈茨木霉幾丁質酶、Hormoconis葡萄糖淀粉酶等同源和異源蛋白以及利用在葡萄糖上強表達的啟動子生產纖維素酶等遺傳工程進行情況。

關鍵詞瑞氏木霉；遺傳改造；基因定位置換整合；重組蛋白

1 前言

多年以來，絲狀真菌及其產生的酶類已廣泛用于食品和食品加工業。由于其在工業上的巨大應用潛力，促進了大規模發酵工程、下游加工工程和對菌株的遺傳改造的發展，其結果有助于將絲狀真菌進一步應用于當今的工業生產。大多數情況下，自然發生的菌株產生我們所需蛋白的水平很低，以至不能在商業上加以利用。因此，為了得到所需的目的蛋白，需對自發菌株進行遺傳改造。隨著分子遺傳技術和真菌基因轉移系統的發展，利用基因工程方法對絲狀真菌進行有目的的遺傳改造，已以成為可能。

絲狀真菌瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是多細胞的真核微生物，其作為工業菌株用于生產分解不同植物材料的酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年歷史。瑞氏木霉所產生的一種主要的纖維酶一纖維二糖水解酶I（cellobiohydrolase1），由單拷貝基因編碼，其產量可達瑞氏木霉胞外分泌性蛋白總量的50%[1]。由此可見，cbh1啟動子是很強的啟動子。因此在對瑞氏木霉的遺傳改造中，常利用cbh1的啟動子與終止子序列構建載體，并利用cbh1的前導肽序列引導重組蛋白進行分泌性表達。瑞氏木霉具有極好的合成蛋白和分泌蛋白的能力；并具有真核的分泌機制，很可能還具有與哺乳動物系統相似的蛋白修飾性能，如：高甘露糖型和N-糖基化[2]等。由于瑞氏木霉具有以上優良性能，再加之其工業化規模發酵條件已比較成熟，這些都促進了對瑞氏木霉的遺傳改造，為同源或異源分泌性蛋白的產生提供了一條行之有效的途徑。

瑞氏木霉不僅具有適于蛋白生產的諸多優點，且對人沒有毒性，在產酶條件下也不產生真菌毒素和抗生素。近年來的實踐表明，經過基因工程手術改造的瑞氏木霉重組菌株是安全無害的[3]。

2 過量生產同源蛋白一纖維素酶與木聚糖酶的生產

纖維素酶廣泛用于淀粉加工、谷物酒精發酵、麥芽制備和釀造、動物飼養以及青貯飲料加工、果汁和蔬菜汁的提取等諸多方面，近年來被應用于紡織、造紙、制漿等工業。由于纖維素酶應用范圍極其廣泛，使得開發和改造纖維素酶生產菌株具有極強的現實意義。瑞氏木霉具有降解纖維素的完全酶系，所分泌的纖維素酶混合物通常包括內切葡聚糖酶等多種酶活力。

1990年，Harkki等報道，通過基因定位置換整合使編碼CBHI的基因失活，結果EGI的產量提高，不再產生CBHI[4]（見圖1）。1993年，Karhunen等報道，將編碼EGI的基因置于強啟動子cbh1的控制之下，用此表達盒替換染色體的cbh1位點之后，EGI的產量是通常強纖維素分解菌所得CBHI量的2倍或者與其一樣多[5]。其他人也曾報道過類似的情況。瑞氏木霉的一個或幾個纖維素酶基因經基因位定位置換整合而失活[6，7]。這些菌株提供了一系列令人感興趣的新酶混合物，即可用于工業生產，又可用于研究不同酶組分對各種纖維底物的分解作用。

但是，基因失活和基因置換的方法，可能不適用于需極高特異和必須去除非必需酶活力的酶制劑。這是因為用于酶生產的培養基，可能會誘導產生大量其它水解酶類。而要使編碼這些酶的基因都失活，在實際當中幾乎是不可能的。為了防止這類問題的產生，Goldman(1992)、Schindler（1993）Nakari(1995)等人先后報道從瑞氏木霉中分離了非纖維素酶基因的啟動子，包括pgk啟動子、pkiA啟動子、tefl啟動子和一個在葡萄糖培養基上強表達但未知的cDNA1的啟動子，這些啟動子可以在葡萄糖培養基上啟動合成所需要的纖維素酶，產生的酶制劑基本上沒有其它纖維素酶活力。在cDNA1啟動子控制下所合成的纖維二糖水解酶和內切葡聚酶產量最高可達50-100mg/L，占分泌蛋白總量50%以上[8]。1996年，Kurzatkowski等構建了能在葡萄糖培養基上生長的瑞氏木霉的重組菌株，其攜帶的木霉糖酶Ⅰ或木霉糖酶Ⅱ結構基因是在內源丙酮酸激酶基因（pkil）表達信號的控制之下表達。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫染色，發現這兩種類型的轉化體在葡萄糖培養基上生長時，能分別分泌出木霉糖酶Ⅰ和木霉糖酶Ⅱ。對于木霉糖酶來說，最好的轉化體產生的特異性酶活力為76U/mg；而對于木霉糖酶Ⅱ來說，則為145U/mg；都大大高出于自發菌株所產生的26U/mg[9]。

3 異源蛋白的生產

3.1真菌酶蛋白類

將Trichoderma harzianum P1染色體上的內切幾丁質酶基因分離，導入絲狀真菌瑞氏木霉，并在cbh1啟動子過量表達。出發菌株瑞氏木霉RutC-30不具有任何內切幾丁質酶活力。T·harzianum內切幾丁質酶基因編碼區前的區段的瑞氏木霉中能正確發揮功能。搖瓶培養產生130mg/L有活力的幾丁質酶，比T·harzianum產生的內切幾丁質酶活力提高大約20倍。瑞氏木霉RutC-30似乎能忍受內切幾丁質酶具有抗植物病原真菌的活力[10]，已被用于植物病源真菌的生物防治。另據B.Cubero等（1997）報道，在瑞氏木霉組成型啟動子ki和cbh2終止子的控制之下構建了兩種載體，分別含有T·harzianum的基因chit33和bgn16.2的開放閱讀框（chit33編碼一種內切幾丁質酶，bgn16.2編碼一種外切葡萄糖淀粉酶），并獲得了穩定的拷貝轉化體。對轉化體bng16.2來說，整合到基因組中的基因拷貝數與mRNA和蛋白質的積累量和在葡萄糖阻遏或幾丁質酶誘導條件下的胞外牧特性酶活力之間均呈正相關。該菌株比野生型菌株能更迅速地抑制病原真菌的生長。對轉化體chit33來說，在葡萄糖阻遏的條件下。對轉化體chit33來說，在葡萄糖阻遏的條件下，其產生的胞外幾丁質酶活力是野生菌株的10倍[11]。

Joutsjoki VV(1994)報道，構建了兩種一步基因置換載體。一種載體含有Hormoconis resinae葡萄糖淀粉酶P的基因組基因（gamP），另一種含有相應的cDNA，都在瑞氏木霉cbh1啟動子控制下表達。這些載體經轉化后置換瑞氏木霉的cbh1基因。在這兩種載體中，cbh1啟動子都能精確地連接到gamP蛋白質編碼區上游，指導瑞氏木霉分泌出有活力的葡萄糖淀粉酶P（GAMP）。這表明gamP基因中內含子序列在瑞氏木霉中得到了正確的加工。研究結果表明，含有gamP cDNA的最優轉化體能分泌大約700mg/L有活力的GAMP，是在H.resinae中產量的20倍[12]，但chb1基因被gamP基因組基因置換的瑞氏木霉轉化體，所分泌的有活性的GAMP要多于含有3拷貝cDNA的轉化體。對瑞氏木霉分泌H.nisresinae葡萄糖淀粉酶P的研究結果表明，自然狀態未成熟GAMP的N端延伸部分可以在瑞氏木霉中作為一種有效的分泌信號，所產生的胞外葡萄糖淀粉酶活力高于以CBHI信號肽作為分泌信號時的情況[13]。

酵母基因在瑞氏木霉中表達的一例是：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DPM1基因（編碼甘露糖基磷酸多萜醇合成酶）的編碼區插入到pLMRS3質粒中，在瑞氏木霉pki啟動子和cbh2終止子控制下表達。在pFG1質粒（含有瑞氏木霉pyr4基因）存在下，與pLMRS3質粒一起對瑞氏木霉的一種pyr4陰性突變株TU-6進行共轉化。然后篩選pyr4陽性轉化子，得到4株多拷貝DPM1基因串聯整合的穩定轉化子。與受體菌株TU-6相比，轉化子的甘露糖基磷酸多萜醇合成酶活力提高了15-19倍，分泌的蛋白總量也提高了4倍[14]。

除以上蛋白外，被表達的真菌蛋白還包括肌醇六磷酸酶等。這些酶都是在cbh1啟動子下表達，搖瓶培養產量達100mg/L水平。發酵培養中，產量為每升幾克。在cbh1啟動子的控制之下，來自擔子菌綱的真菌Phlebia radiate的氧化還原酶（如：漆酶）的產量也達到中等水平

3.2哺乳動物蛋白

瑞氏木霉已被用于牛凝乳蛋白酶的生產。利用cbh1啟動子和終止子，通過共轉化外源基因與來自構巢曲霉（Asp.nidulans）的amdS基因一起引入乙酰胺非利用型菌株。測量到的凝乳酶mRNA和分泌出的凝乳酶的量要比相應的cbh1 mRNA和CBHI的量低1-2個數量級。這表明牛凝乳蛋白酶在瑞氏木霉中的表達受到了轉錄限制。但是，所獲得的40mg/L的水平，與典型的在構巢曲霉素中的2-10mg/L的最初水平相比，還是一個可喜的進步[15，16]。

另外，據文獻報道，利用其它絲狀真菌生產的幾種人體蛋白是：表皮生長因子（hEGF），生產激素（hGH），白細胞介素6，組織血纖維蛋白溶酶原激活因子（htPA）等。

Fab分子是由抗體完整的輕鏈和重鏈的Fd部分，由鏈間二硫鏈連接在一起。這種分子曾由木霉成功地生產出來，并用于研究其分泌過程。利用cbh1啟動子和信號序列，分別構建了表達輕鏈和重鏈的表達盒。首先構建的是只產生輕鏈的菌株，然后用2種不同的重鏈表達載體進行再轉化。這兩種載體分別指導Fd鏈或者與CBHI核心-連接區融合在Fd鏈的表達。只產生輕鏈的菌株分泌的輕鏈水平很低（0.2mg/L）。對前一種重鏈載體的轉化體來說，在搖瓶培養中，分泌的有可能的Fab分子為1mg/L。在具有cbh1-Fd融合結構的轉化體菌株中，觀察到產量有顯著增長。最優菌株能分泌40mg/L具有免疫活力的CHBI-Fab融合蛋白。在發酵培養中，水平增長到150mg/L.然而，沒有融合到CBHI上的Fab分子，水平仍為1mg/L。有趣的是，一種未知的木霉蛋白酶在CBHI-Fab融合蛋白的N-端特異去除2個氨基酸，能產生少量的Fab分子。釋放的Fab分子表現出免疫活性和對抗原的親和性，而CBHI-Fab分子的免疫活性要低5-12倍。對分離到的抗體鏈進行定量測定表明，分泌出的所有輕鏈都和重鏈組裝在一起。CBHI-Fab產物的上清液中，含有顯著數量（800mg/L）的CBHI核心-連接區肽，它們來自CBHI-Fd融合分子。這樣，CBHI-Fd的產生是非常有效的（大于800mg/L），但其中只有少量（40mg/L）裝配成有功能的CBHI-Fab分子（或者，釋放的Fab分子）。這表明輕鏈的產生可能是限制性因素[17，18]。

4 總結

絲狀真菌瑞氏木霉已被成功地用于生產同源和異源蛋白。利用基因工程構建具新生狀的菌株，在蛋白類物質的生產方面已取得重要進展。其中，在提高絲狀真菌異原蛋白產量的過程中，基因融合的方法特別值得注意。典型作法是，將編碼有目的蛋白的基因融合到自然情況下分泌性良好的內源蛋白基因如葡萄糖淀粉酶、纖維二糖水解酶基因的下游。這種方法已在由Asp.awamori分泌牛凝乳蛋白酶（Ward等，1990），Asp.nidulans分泌白細胞介素6的過程中，被證明有效的（Contreras等，1991）。有趣的是，當外源蛋白整合到CBHI核心-連接區上時，產量能夠提高。在牛凝乳蛋白酶的例子中，產量提高3-5倍；就抗體片段而言，產量提高50多倍（Nyysonen等地993）。

由上可見，在瑞氏木霉中已發現出多種分子系統，采用不同的策略用于同源和異源蛋白的生產。為了提高產量，使用強表達和有效分泌纖維素酶CBHI基因的不同部分，已被證明是一種有效的方法。雖然在基因組的分區段也可獲得外源基因的有效表達，但cbh1啟動子很強，而且cbh1位點對于表達似乎也有益。將外源蛋白融合到CBHI的核心-連接區，能夠恢復對高水平表達起重要作用的區段，如：翻譯起始位點、信號肽序列及其作用位點。通過基因工程和發醇培養生產同源和異源蛋白，需要進一步地改進。對于不同的培養條件，包括含葡萄糖的培養基，應該發展出不同的生產策略，策略和技術的發展將會拓寬瑞氏木霉生產重組蛋白的范圍。由于瑞氏木霉在大規模生產條件中（高達360m2發酵液）的良好表現，所以它特別適于所需大量蛋白的生產[19]。遺憾的是，目前國內在這方面的研究尚未見報導。山東大學微生物技術國家重點實驗室正在開展對于瑞氏木霉的分子生物學研究，已克隆到瑞氏木霉進行菌株改造，通過基因定位置換整合，破壞其木糖醇脫氫酶基因，從而構建木糖醇生產菌。

隨著瑞氏木霉分子生物學研究的開展及基因工程的瑞氏木霉的應用，使我們構建多種具有良好商業潛力的菌株成為可能。我們相信利用木霉大量生產多種酶和藥用產品，將不斷被證明是行之有效的。

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Advane of Molecular Biology in the Production of Recombinant Proteins by Filamentous Fungus Trichoderma reesei

第8篇：分子生物學研究范文

關鍵詞：生命科學；國際化人才培養；分子生物學

中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2015）37-0073-02

《國家中長期教育改革和發展規劃綱要（2010-2020年）》明確提出，要開展多層次、寬領域的教育交流與合作，提高我國研究生教育國際化水平。必須承認，我國目前在生命科學學生教育方面，無論是本科生還是研究生，與國外學生的教育國家化發展模式和效果還存在巨大差異，因此以國外生命科學學生的教育國際化的發展經驗為參考，構建適合中國國情的國際化培養模式，對于提升我國生命科學學生的教育水平和層次具有非常重要的現實意義。目前，生命科學已經成為世界科學前沿最活躍的學科，是代表科學發展方向的學科之一。目前在世界范圍內逐漸形成了這樣的共識：生物技術將成為21世紀主導社會發展的主要支柱產業之一。人類正在進入生物學時代，生物學正在越來越多地被應用于解決醫藥領域問題、科技制造業、綠色能源以及農業和環境保護等很多重大方面。而美國白宮也在2012年了“國家生物經濟”藍圖，提出未來美國政府在生物經濟方面的戰略性使命。在這一新形勢下，把培養具備國際競爭能力的以及一定自主創新能力的高素質的創新型人才作為生命科學學生培養的目標，并在構建生命科學學科學生的國際化培養的新模式方面進行有益的嘗試將變得異常重要。有很多學者發表關于哈佛大學和麻省理工學院人才培養模式的論文，如喬敏等的《學習哈佛經驗建立基礎醫學整合課程體系的實踐》、袁力的《中美大學本科課程體系比較及啟示》、于歆杰的《麻省理工學院教育教學考察報告（二）――培養方案與課程設置篇》、蔣景華《麻省理工學院培養創新人才特色做法的分析研究》等，但關于國外生命科學人才培養模式的文章很少，只檢索到肖尊安的《淺析國外大學生物科學人才的培養》和夏薇的《麻省理工學院和清華大學生物學專業課程設置比較》等。近年來我國的高等生命科學人才培養已加快了改革和調整的步伐并取得了一些成果。清華大學、北京大學生命科學人才培養與科學研究改革試點已經考試啟動，其總目標是：在清華大學生命科學中心和北京大學生命科學中心的基礎上，建立生命科學人才培養與科學研究改革試點（簡稱改革試點），兩個中心研究方向各有側重，優勢互補，資源共用，統一實施和管理，并為實現該目標制定了明確的改革措施。吉林大學、浙江大學、武漢大學等國內一流大學已經紛紛開始進行生命科學學生國際化培養模式的改革。而分子生物學做為現代生命科學的基礎學科，發展異常迅猛，以分子生物學課程為探索國際化培養模式的試點非常必要。因此，我們在遼寧大學生命科學院以中英雙語教學課程分子生物學課程為例，進行了一系列的改革措施，借以探索生命科學本科學生的國際化培養模式。

一、改革的目標及具體改革內容

以分子生物學課程的國際化實踐為試點，為進行遼寧大學生命科學院現代生命科學國際化人才培養模式的探討提供參考。

1.教學理念方面的改革：分子生物學課程是一門嶄新的課程，作為現代生命科學的基礎學科，發展異常迅猛。這就要求分子生物課程的教學理念也要符合其發展特點。在教學理念上破除陳舊的照本宣科和一成不變的教學模式，發揮教師的主動性和創新性，鼓勵教師從自己的學術科研實踐出發，把前沿的學科發展動態同教材內容相結合，拓寬專業教育范圍，把培養國際型實用人才做為教學理念貫穿整個教學過程。

2.教學內容方面的改革：分子生物學的前沿發展非常深入和迅速，這就要求分子生物學教學內容設置的最重要的標準必須是強調教材內容的先進性，這樣才能保證所傳授的內容不落伍。改變之前所用傳統分子生物學的中文教材，通過使用與國際接軌的先進教材《Molecular Biology of the Gene》（科學出版社，J.D.，沃森等編著，楊煥明等譯），以及自制的以該教材英文版為參考的全英文PPT課件，使教學的內容始終保持與學科的前沿發展契合（圖1）。同時在每學期的教學中都根據學科發展的現狀，合理并及時運用該教材編撰者在冷泉港實驗室隨時更新的最新的分子生物學教學動畫及其他教學材料（圖2），以及哈佛大學或麻省理工學院相關課程的教學輔助參考資料，這樣做到隨時進行知識更新，以跟進教材更新和修訂周期中的學科發展動態，激發學生的學習積極性。

3.教學方法方面的改革：分子生物學是一門理論和教學結合非常緊密的學科。任何一個知識點都從具體的實驗數據得來，而學術和實驗能力是分子生物學教學的一個重要指標。在教學實踐中理論部分利用研究式、討論式（如第三四五章分子間的弱相互作用重要性的討論，為分子生物學相關化學基礎知識，由討論課形式完成）、啟發式、等教學方法，以解決問題為出發點，將某些相關的理論形成過程分析出來，并就形成過程中的一些關鍵知識點提出問題，促進學生思考，培養學生的學術研究精神。另外，開展多彩多樣的課外活動，包括小型研究課題、實驗技術訓練和知識拓展講座等。同時，開展“本科生導師制”工作，鼓勵學生參與任課教師的學術科研實踐，以實現教學與科研相互促進的目標。

4.考核標準改革：改變原考試只重視期末考試卷面成績的做法，分子生物學考試改革改為出勤率、平時學術小論文報告、課堂討論及發表并結合期末卷面成績的做法，監督和培養學生平時夯實學習基礎知識的好習慣，并激發學生的創新思維能力的培養。

二、具體實施方案

1.建立國際化的教學隊伍與科學、公正的評價制度：引進具有國際化背景的分子生物學專業的教師承擔部分教學任務，通過開展廣泛的討論與監督，評價學生對該學科的學習成果。

2.寓教于研，建立國際化的拔尖創新人才的培養體系：以遼寧大學本科生導師制度為依托，吸引優秀的本科學生參與到任課教師的學術實踐中。通過課題中子課題任務的承擔和參與，強化其對分子生物學課程的理解，提高其興趣。

3.制定國際化的分子生物學課程教學指導方案。構建國際化的本科生培養方案，將為提高研究生的國際競爭能力奠定堅實的基礎。通過借鑒國外高水平生命科學學科的課程體系，進一步優化了課程結構，制定符合自身特色的本科生國際化培養方案。

4.開展多種形式的國際化學術交流活動。遼寧大學生命科學院的承擔分子生物學及相關課程如基因工程、分子遺傳學、細胞生物學以及細胞信號轉導等專業的任課教師絕大多數都有海外工作或者留學經歷，并且與國外保持著密切的聯系。分子生物學教研室充分利用這些教師資源，利用遼寧大學的“暑假小學期”制度，定期邀請國內外分子生物學相關領域的專家及學者來院講學及交流，為學生開設各種形式的前沿講座和報告。這些措施使學生能夠與外籍專家近距離的交流和學習，讓學生能深刻體會到國外先進的教育理念和教學方式，感受國外先進的教育理念和教學方式，領略國際一流學者的風度和學識，從而激發學生的求知欲，為他們在國際學術舞臺上展現自己的渴望增加了助力。

通過以上改革，學生對分子生物學課程學習的興趣顯著提升，課堂出勤率顯著增加，學習成績也有大幅度提高。同時，通過對分子生物學課程學習的引導，學生對分子生物學相關學科如細胞生物學、分子遺傳學等以及其他生命科學學科產生了濃厚的興趣，對提振生命科學本科學生的學習風氣起到了積極的促進作用。學生的國際化視野得到了拓展，用英語討論分子生物學學術研究熱點的能力得到了鍛煉，對國際學術環境有了較為整體的了解，而這些也使得本院本科生在聯系國際知名大學繼續求學深造的過程中競爭力大大提高，并且陸續獲得了美國和日本等國際知名大學的錄取。通過以上實踐，希望我們的分子生物學課程教學改革對生命科學國際化人才培養模式能有所參考。

參考文獻：

第9篇：分子生物學研究范文

百日草（zinnia elegans）屬菊科百日草屬的1a生草本植物，是重要的園林觀賞花卉；其葉片花序可入藥，有消炎，祛濕熱的作用。在吉林農業科技學院校園內種植有大量的百日草，調查發現百日草白粉病發生較為嚴重，主要危害植株的葉、葉柄和花瓣，孢子堆生于葉片正、反面 、葉柄和花瓣上。發病初期，葉面出現零星的白色小粉斑，擴大后為圓形病斑，白粉斑可相互連接成片，有時白粉層覆蓋整個葉片[1]。目前國內尚未見關于百日草白粉病無性孢子生物學特性的系統研究報道[2-3]，為此，本試驗為百日草白粉病無性孢子生物學特性進行研究，為防治百日草白粉病提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

百日草白粉病無性孢子采自百日草白粉病無性孢子采自新城局農業站院內發生白粉病的百日草的病葉上；供試碳源為蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、淀粉；供試氮源為谷氨酸、硝酸鈉、硝酸銨、硝酸鈣、氯化銨、尿素；其他本文由收集整理材料有0.1%naoh溶液、0.1%hcl溶液等。

1.2試驗方法

1.2.1 不同溫度培養條件對孢子萌發的影響

取新鮮的洋蔥表皮1㎝×1㎝，在75%酒精中浸泡1周，再取出洋蔥表皮放入無菌水中清洗。用清洗過的洋蔥表皮蘸取適量的百日草病葉上的白粉病無性孢子，在顯微鏡4倍鏡下單一視野內孢子數量不少于30個，觀察記錄總數不少于200個。將蘸有病菌無性孢子的洋蔥表皮置于盛有無菌水的培養皿中，每個培養皿3片。將培養皿分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒溫生化培養箱（shp-1500，中國上海精宏有限公司）中，共7個處理，3次重復，培養48h后，將洋蔥表皮置于載玻片上在顯微鏡下觀察并記錄孢子萌況。

1.2.2 不同光照培養條件對孢子萌發的影響

按照2.2.1的方法將蘸有病菌無性孢子的洋蔥表皮置于盛有無菌水的培養皿中，分別置于全光照、全黑暗、光暗交替條件下于恒溫生化培養箱中[4]，共3個處理，3次重復，培養48h后，將洋蔥表皮置于載玻片上在顯微鏡下觀察并記錄孢子萌況。

1.2.3 不同ph培養條件對孢子萌發的影響

按照2.2.1的方法將蘸有病菌無性孢子的洋蔥表皮分別置于盛有以0.1%naoh溶液和0.1%hcl溶液配置的ph為4、5、6、7、8、9、10的培養皿中[5-6]，共7個處理，3次重復，置于25℃恒溫生化培養箱中培養48h后，將洋蔥表皮置于載玻片上在顯微鏡下觀察并記錄孢子萌況。

1.2.4 不同碳源培養條件對孢子萌發的影響

按照2.2.1的方法將蘸有病菌無性孢子的洋蔥表皮置于盛有0.5%葡萄糖溶液的培養皿中，每個培養皿3片。再分別以蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉代替葡萄糖，共5個處理，3次重復，置于25℃恒溫生化培養箱中培養48h后，將洋蔥表皮置于載玻片上在顯微鏡下觀察并記錄孢子萌況。

1.2.5 不同氮源培養條件對孢子萌發的影響

按照2.2.1的方法將蘸有病菌無性孢子的洋蔥表皮置于盛有0.2%谷氨酸溶液的培養皿中。再分別以硝酸鈉、硝酸銨、硝酸鈣、氯化銨、尿素代替谷氨酸，共6個處理，3次重復，置于25℃恒溫生化培養箱中培養48h后，將洋蔥表皮置于載玻片上在顯微鏡下觀察并記錄孢子萌況。

2 結果與分析

不同溫度培養條件對孢子萌發的影響 見表1。

由表1可見，不同溫度對孢子萌發率有較大的影響，其中25℃處理與其它處理間有顯著性差異，但并未達到極顯著水平。所以，25℃更適于百日草白粉病無性孢子的萌發。其中5℃、10℃、35℃萌發率極低，說明低溫及高溫對孢子萌發有抑制作用。

不同光照培養條件對孢子萌發的影響 見表2。

由表2可見，記錄的數據經數理統計分析后，光暗交替與全光照、全黑暗有顯著性差異，但無極顯著性差異；全光照與全黑暗之間無差異。因此最適光照條件為光暗交替。

2.3 不同ph值培養條件對孢子萌發的影響 見表3。

由表3可見，在ph=4～10范圍內均可萌發，其中ph=8與其它處理間差異顯著。孢子萌發率最快即為孢子萌發最適ph值。ph=4、ph=10的處理孢子萌發率較低，說明強酸，強堿對孢子萌發有抑制作用。

2.4 不同碳源培養條件對孢子萌發的影響

見表4。

由表4可見，記錄數據經分析后得，孢子萌發率：淀粉>葡萄糖>乳糖>蔗糖>麥芽糖，其中淀粉處理萌發率最高，為60.97%。淀粉、葡萄糖、乳糖處理差異不顯著，所以孢子萌發適宜碳源為葡萄糖、乳糖，最適碳源為淀粉。

由表5可見，在各種氮源的培養液中，孢子均能萌發，尤以硝酸鈣為氮源的處理孢子萌發率最高。且硝酸鈣與氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、尿素、谷氨酸處理間有顯著性差異。因此硝酸銨為最適氮源。