水產養殖弧菌的處理精選(九篇)
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第1篇：水產養殖弧菌的處理范文
（廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088）
摘要：研究葡萄糖的不同添加量（1.25～5×10-3 g/L）對對蝦養殖水體水質指標（氨氮、活性磷）和微生物數量（總異養菌、弧菌）的影響。結果顯示，與對照組相比，水體中添加葡萄糖能明顯提高異養菌、弧菌密度（P＜0.05），顯著降低養殖水體中氨氮、活性磷濃度（P＜0.05）。且在一定濃度范圍內，葡萄糖濃度越高，氨氮、活性磷濃度越低，異養菌、弧菌密度越高。
關鍵詞 ：碳源；凡納濱對蝦；水質
中圖分類號：S942
近年來，對蝦養殖業已成為我國主要的養殖業之一，其養殖產量占了全球對蝦養殖產量的1/3。但是，隨著養殖技術的發展，集約化、高密度、高產量的養殖方式導致水體污染日趨嚴重，甚至病害發生日益頻繁。水體中污染因素主要是養殖生物的排泄物、殘餌以及有機碎屑等，這些物質不斷被氧化分解，導致氨氮等有害物質的積累，可造成養殖生物中毒[1]。養殖水體的水質調控已經成為對蝦養殖者和科研工作者最關注的問題之一，去除氨氮等有害物質常用的方法有換水、添加化學試劑和生物修復等。頻繁換水容易導致水資源浪費，人為添加化學試劑造成藥物殘留，污染海區，所以生物修復技術成為當今水產養殖水處理的研究熱點。生物修復，即通過生物-生態措施，修復受損的池塘生態系統，加速生態系統的物質循環和能量循環，增加水體溶氧，改善水質和池塘自凈能力[2]。主要有向水體中投加有益微生物[3]，或定向培育有益微藻[4]等措施，加強對有機污染物的分解和提高池塘的自凈能力。但是水體中微藻的密度受天氣等各方面因素的影響，難以控制數量，如果微藻數量過大，而天氣連續陰雨，容易造成微藻大量死亡，敗壞水質。向水體中投加有益微生物改善水質，有其優勢，容易大量培養，可操作性強，受到養殖戶的青睞，在水產養殖中應用廣泛。但是微生物在水體中能否生存與繁殖，受到環境條件的限制。有研究表明，加入碳類物質可以增加養殖系統中細菌生物量[5]，且在高碳氮比的情況下，異養菌所具有的優勢更加明顯[6]，從而水體中的氮也消耗更多。近年來，少數研究者向養殖水體或富營養化水體中加入碳源，達到降低水體中的氨氮的目的[7-11]。
葡萄糖是多糖最基本的組成單位，因此研究葡萄糖在廢水凈化中的作用就顯得更加重要[12]。李洪鵬等[12]等認為葡萄糖添加量在一定范圍內，氨氮等污染物的去除率均隨添加量的增加而升高，當葡萄糖添加量高于某一臨界值時，去除率將隨葡萄糖的增加而下降。關于向對蝦養殖水體中添加不同濃度的葡萄糖進行水質凈化的研究未見有報道。本文旨在研究葡萄糖的不同添加量對凡納濱對蝦（Litopeneaus vannamei）養殖水體水質和微生物數量的影響，探討葡萄糖的添加量與水體中氨氮、活性磷濃度和微生物數量的關系，以期為對蝦養殖過程中的水質調控提供理論參考。 1材料與方法
1.1實驗動物
養殖對象為健康的凡納濱對蝦，平均質量6 g。對蝦飼料為粵海牌2#對蝦料。葡萄糖為廣東光華科技有限公司生產。
1.2細菌培養基
異養菌培養基（2216E）：蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，磷酸鐵0.01 g，瓊脂16.0 g，陳海水1 000 mL，調pH 至7.6～7.8。
弧菌培養基（TCBS）：北京陸橋技術有限責任公司生產。
1.3養殖管理
養殖容器為玻璃鋼桶，養殖水體100 L。養殖期間，連續充氧，保證水體中氧氣的充足，為防止充氣過大而將對蝦殘餌或糞便打散，造成實驗誤差，氣石的擺放位置為養殖桶的邊緣。每天按8%的量投喂餌料，每天投喂時間8:00，12:00，17:00，22:00。每天每個桶吸污1次，吸污量為10 L。水溫（28±1） ℃，pH 8.0±0.2。
1.4實驗方案
實驗分為5個組，每組3個平行，每個實驗桶放凡納濱對蝦40尾。每天早上投料后投放不同濃度的葡萄糖。葡萄糖的投放量根據投餌量確定（葡萄糖投放量見表1）。
每隔48 h檢測氨氮和活性磷一次。氨氮采用納氏試劑法[13]，活性磷采用磷鉬藍法[13]。每96 h檢測總異養菌和弧菌數量一次。
2結果與分析
2.1添加不同濃度的葡萄糖對對蝦養殖水體總細菌的影響
在實驗期間，所有實驗組水體中總異養菌的數量隨養殖時間的延長呈上升趨勢，說明添加葡萄糖有利于養殖水體中異養菌的增殖。在12 d時，組3、組4和組5的養殖水體中總異養菌的數量都顯著高于對照組（P＜0.05）。在16 d時，組5的養殖水體中的總異養菌的數量出現明顯下降，且低于對照組，但其余各組的養殖水體中的總異養菌的數量仍高于對照組。組5的細菌密度前期高而后期突然降低的原因，是由于實驗開始時組5的外加碳源最多，細菌量因營養豐富而迅速增加，同時營養物質也因細菌量增加而消耗更多，但實驗期間水體中的碳源不再補充濃度不斷降低，氮的來源還是與其他組一樣來自殘餌和糞便，導致實驗后期細菌密度下降較快，見表2。
2.2添加不同濃度的葡萄糖對對蝦養殖水體弧菌的影響
在實驗期間，所有實驗組水體中弧菌的數量隨養殖時間的延長也有所上升。從實驗結果來看，添加葡萄糖也會導致養殖水體中弧菌的數量的上升。組5在加入葡萄糖后的各個時間點養殖水體中弧菌的數量都顯著高于對照組（P＜0?05），見表3。
2.3添加不同濃度的葡萄糖對對蝦養殖水體氨氮的影響
如圖1所示，由于養殖期間水體中殘餌和對蝦糞便的積累，在實驗前期對照組和處理組的氨氮含量均呈上升趨勢；但添加葡萄糖后的8 d以后，對照組的氨氮含量繼續呈上升趨勢，而各處理組的呈下降趨勢，其中葡萄糖濃度高的組4、組5下降最明顯；第14 d的檢測結果顯示，組4、組5的氨氮含量顯著低于對照組（p＜0.05）。筆者認為，葡萄糖的添加加速了水體中異養菌的繁殖和生長，消耗了大量的氮源，從而氨氮含量下降，且葡萄糖濃度越高的組，氨氮濃度下降越明顯。
2.4添加不同濃度的葡萄糖對對蝦養殖水體活性磷的影響
海水養殖的生態系統中，磷是物質循環的重要組成成分，也是細菌的重要生長因子，其存在形式和多寡，能促進或限制生態系統的能量轉化，是影響養殖水環境的重要因素。如圖2所示，由于餌料的添加，實驗早期（6 d以內）各組的養殖水體中活性磷的含量均呈上升趨勢，各組間差異不顯著；第6 d以后，對照組、組2和組3的活性磷含量繼續上升，而組4、組5的活性磷含量比較平穩；第14 d檢測結果顯示，組2、組3的活性磷含量與對照組差異不顯著，組4、組5顯著低于對照組（p＜0.05）。說明在水體中添加葡萄糖后，葡萄糖濃度高的組水體中異養菌大量生長和繁殖，明顯消耗大量的活性磷。
3討論
3.1對蝦養殖水體的水質調控
在水產養殖過程中，水質的好壞直接影響養殖生物的生長與存活，從而影響養殖效益。隨著高產、高密度的對蝦養殖業的發展，養殖水體中常因池中殘餌、水生生物排泄物及尸體等的腐敗、分解，引起水質惡化，使水中營養元素N、P等發生非正常變化并產生有害物質[14]。這些有害物質被海水溶解或經過微生物的分解和礦化作用產生可溶性營養物質進入養殖水體，一部分被浮游植物利用，一部分通過換水進入海區，還有一部分會在養殖水體中積累，在水體中積累到一定濃度后，將對養殖生物產生一定的毒害作用。楊世平等[14]通過對對蝦高密度養殖池中水質的連續監測，認為養殖水體的污染主要是含氮廢物的污染，在高密度養殖池養殖后期，水體中氨氮首先達到峰值2.32 mg/L，隨后亞硝酸鹽的含量也迅速達到峰值0.773 mg/L，在高密度養殖池中活性磷的含量也較高。Li等[15]認為，水體中氨氮含量將隨著餌料中蛋白質含量和蛋白質投喂量的增加而增加。餌料在水中的降解過程中不斷的釋放氨氮和有機碳。潘云峰等[16]認為水體中的氨氮有三個階段動態的變化階段：第一階段微生物對氨氮的利用小于餌料降解的氨氮，造成氨氮不斷升高，第二階段微生物對氨氮的利用和餌料降解的氨氮相等，造成氨氮在水中殘留達到最大值，第三階段微生物對氨氮的利用大于餌料降解的氨氮，造成氨氮降低。本實驗結果也顯示，實驗早期氨氮含量呈上升趨勢，濃度上升到一定高時開始降低。
針對對蝦養殖水體的水質污染，利用可控的人工措施，采用物理、化學或生物等方法調控水質，改善養殖水體環境。常用物理方法包括物理過濾、沉淀、泡沫分離等，物理方法凈化水體的優點在于無二次污染，但費時費力。常見的化學方法包括絡合、氧化還原、臭氧消毒等，消毒效果不錯，但使用不當可能會對養殖水體造成二次污染。生物方法是利用微生物或自養性植物(如綠色藻類、高等水生植物)改良水質，其原理是這些微生物和植物可以吸收利用水體中的營養物質(殘餌及水產養殖動物的代謝產物)，有助于防止殘餌與代謝產物積累所引起的水質敗壞[17]。由于生物方法處理水質具有成本低、無污染等特點，近年來越來越受到人們的青睞，人們在處理對蝦養殖水體時，常引入細菌[18]或微藻[4,19]改善水質。但是池塘中微藻的密度受天氣等各方面因素的影響，難以控制數量，藻種供應商品化程度較低，相對而言細菌具有可操作性的特點，生產、儲存和運輸都不存在問題，所以生產上應用最多。但是，在實際操作過程中被投入到養殖水體的細菌能否存活和生長，受到水體環境的影響，將直接影響水質處理效果。人們發現在水體修復過程中，水體中可被生物利用有機物含量較低或缺乏氮、磷元素時，修復效果較差，添加某種營養物質可以加強生物修復[20]。
3.2養殖水體中添加碳源對水質的影響
細菌所需要的營養物質與其細胞的化學構成大致相同，大致有5 類：碳源、氮源、磷源、無機鹽和生長因子[10]。水體中氨氮的去除，主要是通過細菌固定和轉化，但對于細菌來講，養殖池一般是屬于氮源過剩，而碳源缺乏的環境，經常限制細菌生長的是碳源[21]。故添加一定的碳源才有利于細菌對氨氮的轉化。近年來，許多研究者為降低水體中的氮污染，而向水體中添加碳源，取得了較好的效果。如李彥等[5]研究發現，向羅非魚養殖池塘添加碳源可以降低池塘水體氨態氮含量，趙志剛等也研究發現，定期向松浦鏡鯉養殖池塘添加碳源可顯著降低池塘水體氨態氮含量[8]。Hari[11]等研究碳源對對蝦養殖水體水質的影響，也認為添加碳源可以顯著降低水體中氨氮濃度。常用的外加碳源有甲醇、乙醇、乙酸、乙酸鈉和葡萄糖等[10]。其中葡萄糖是多糖最基本的組成單位，是一種重要的簡單碳水化合物，它在主要的生化途徑中有重要作用。有研究已證明葡萄糖在水質處理方面效果較好，如李洪鵬等[12]報道證實添加葡萄糖能提高原生態復合菌的凈化能力，張海杰等[22]研究證實葡萄糖作為外加碳源時微生物的硝化率最高。本實驗中對照組的氨氮含量一直呈上升趨勢，而處理組由于添加了葡萄糖作為細菌的碳源，氨氮因被細菌利用而含量出現不同程度的下降，且碳源濃度投放量高的處理組（組4、組5）氨氮濃度下降最為明顯。
向水體中添加葡萄糖等碳源后，水體中的氨氮濃度降低，氮源被細菌所利用變成細菌菌體的一部分，但是并沒有直接離開水體。那么，氮源會隨著細菌的代謝和死亡重新回到水體中嗎？有研究認為細菌在生長過程中會分泌多糖、多肽、蛋白質、脂類及其復合物等胞外產物，與水中的一些懸浮物質通過微生物分泌的胞外產物產生正負電荷吸引中和會形成絮凝體[23]，絮凝體容易被過濾或沉淀而離開養殖水體。而且形成的絮凝體還可能被魚類、蝦類重新攝食，提高餌料的利用率和凈化水質[16]。所以向對蝦養殖水體中添加適量的葡萄糖等碳源有利于水質凈化和對蝦健康養殖。
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秦皇島市近岸海域環境大幅改善 漁業生產保持穩定增長態勢
第2篇：水產養殖弧菌的處理范文
1益生菌群的作用
1．1益生菌群是水體物質循環的推動者
1．2益生菌群在水體污染中的指示作用
1．3益生菌可以凈化水體
1．4益生菌群作為餌料的作用
1．5益生菌群能防止病害
1．6益生菌群可以刺激提高免疫力
2益生菌的研究現狀
國內對于水產動物病害的研究起步較晚。于占國等在論述異養菌于對蝦病的關系的研究時特別指明：弧菌喜歡在富營養環境生長，并已經成為蝦池中的優勢菌屬。它的數量與對蝦發病有著密切的關系。薛清剛還指出：在全世界主要對蝦養殖區，弧菌病到目前為止仍時對蝦危害最大、造成損失最嚴重的疾病之一，它影響著所有種類對蝦的幾乎所有發育期，在養殖條件下容易爆發性流行，且流行范圍已遍及全球。如不及時采取妥善治療措施，其危害后果是在短時間內死亡率為100％，即使采取一些控制措施，也仍有很高的死亡率。許兵等（1993）曾對中國對蝦病原菌及其致病機理作過探討。孟慶顯在其論著中也記述了弧菌的危害。供給養殖生物一個包括有益微生物群落在內的健康環境是很重要的。從養殖環境中除去細菌或使用抗微生物藥物控制細菌種群將會使生態平衡遭到破壞，因此，使用益生菌將具有很大的潛力。但在水產養殖過程中有效使用益生菌的證據還比較缺乏，而且其準確的作用機理方式也不十分清楚，尤其是菌株體外抑菌物質的產生或是競爭營養與其體內益生菌效果的關系。益生菌在水生動物體內與其他菌群的相互作用仍然需要闡明，益生菌的免疫刺激效果也值得進一步研究。為了益生菌能應用于水產養殖，必須對其大規模生產條件下的生產工藝流程、多種菌的生產、保藏及確保其質量方面進行深入地研究。
3水生環境微生物的分離和鑒別
海洋細菌中普遍都存在著抗菌性。許多海洋抗菌微生物屬于假單胞菌或者是弧菌。淡水微生物群中也普遍存在著抗菌活性。某些乳酸菌也對魚類的病原菌有抵抗能力。在許多體外實驗中，致病的弧菌和氣單胞菌都會被抑制。而且一些細菌對于濾過性細菌也具有一定的抵抗能力，因此它們可以作為濾過性細菌的生物防治劑。值得注意的是不但抗菌素具有抑制微生物病原菌的能力，其它一些物質也具有相同的作用，如有機酸，過氧化氫，含鐵細胞等。這些物質的抗菌能力很大程度上依賴于實驗條件，而這些對于體內和體外是不同的。因此，這些抗菌性菌株的在體外的實驗是不足以作為篩選候選益生菌的唯一標準，也不能僅僅憑此來進行菌株的篩選。在魚的幼苗和甲殼類動物中，通過解剖分開胃和腸道可以從消化系統分離出不同的微生物群。附著在上皮細胞上的微生物可以從其附著部分的黏液中分離得到。這種分離方法不適用于幼蟲狀態和活著的養殖餌料，但是可以用0.1％苯甲銨氯化物的鹽溶液來沖洗魚幼苗的外表來分離附著在表面的微生物，這些微生物也來自于通過它們腸道內的排泄物。多數微生物可以用選擇性培養基進行分離篩選。然后可以通過一些常規方法對它們進行鑒別。
4益生菌在水產動物中的應用情況
益生菌的概念是在應與于陸地生物的過程中發展起來的，對于水生生物卻還是有許多的不同之處，最基本的問題是益生菌在水體養殖環境中的應用。人類和陸地生物經歷了一個在胞衣中由胚胎發育的過程，然而大多數的魚和貝類在最初的個體發育階段都是在外部環境中進行的。因為它們的幼蟲在消化系統還沒有完全發育好，而且免疫系統還不完善，此時就開始喂食，它們腸道內相關微生物菌群混亂的情況會很大。因此，在幼蟲階段特別需要使用益生菌。在人類和陸地養殖動物的腸道微生物菌群中，格蘭氏陽性專一性活兼性厭氧性微生物占有優勢地位。在人類排泄物中，主要的微生物群是類桿菌，格蘭氏陽性厭氧球菌，真菌和雙歧桿菌，而在豬的排泄物中其主要的微生物菌群是]鏈球菌和乳酸菌。大部分益生菌都屬于這些微生物群中的主要或者次主要種屬，如雙歧桿菌，乳酸菌和鏈球菌。在魚和貝類的消化道里格蘭氏陰性兼性厭氧菌占主要，而在某些食草的熱帶魚中，共生的厭氧菌占主導。弧菌和假單胞菌在甲殼類生物，海魚和雙殼類生物中很普遍。在淡水魚中，氣單胞菌和腸桿菌占有優勢。水體微生物群特性的一系列結果說明可以有效應用于水產養殖的益生菌與來自于陸地的種類有些不同。在人類和陸地家畜的腸道為生長于其中的微生物創造了一個公平穩定的居住環境，它們由此受益。然而，在水生動物中，大部分的微生物群都是暫時的。這些動物都是變溫的，它們相關的微生物群會隨著溫度的變化而改變。鹽度的變化也會影響微生物群，而海魚不得不經常的喝水以補充身體水分的損失。持續的水的進入增強了周圍環境的影響能力，同時，根據觀察一些濾食動物如雙殼類，蝦幼蟲及其食物，我們也發現了這一點。對于幼蟲來說，由于缺少胃的保護作用，這些影響是很重要的。所以，水生動物腸道內的微生物群會因為來自于水和食物的微生物群而發生很快的改變。在雙殼類生物中，其相關的微生物群和那些海水和沉淀物中的非常相似。在Penaeusjaponicus對蝦的內臟和海水中也發現了相同的細菌，但是微生物群中正常的種群是通過食物引入的。在魚的幼蟲和幼苗階段，食物的影響是決定性的。而且，在第一次的喂食中，通過活的食物帶入的細菌的影響是非常顯著的。第一次用于水產養殖的益生菌本來是設計給陸地動物使用的。一株分離自土壤的細菌孢子可以降低因感染愛德華氏菌日本鰻鱺的死亡率，相同的飼料添加物可以提高鯡魚的生長率。孢子可以很容易的混在復合食物中，但是還沒有有關它們在魚的消化道中生長繁殖的實驗方面的報道。對于孢子在腸道內的生長情況取決于停留的時間和養殖的溫度，這一點是值得去研究的。Kozasa使用的菌株在輪蟲中進行了試驗，可以提高大比目魚的生長速率，但是在其幼苗階段和輪蟲中都沒有發現這種微生物群。稍后，另一組實驗使用了含有桿菌IP5832孢子的飼料添加物，通過計數和鑒別與用孢子飼養的輪蟲和大比目魚相關的細菌的特征來檢驗其效果。實驗表明，當把孢子加入到水中一小時之后，其可以生長的菌株的數目急劇下降，大部分的桿菌孢子在不到一個半小時內濾過吸收。這些孢子因此可以在輪蟲中復活生長，但是這段時間可能太短以至于益生菌還來不及發揮其作用。許多細菌可以產生抗生素，特別是在孢子形成階段，通過植物細胞的蛋白質水解也可以生產抗生素。當輪蟲用孢子飼養時，其弧菌的數目會降低，這可能是由于桿菌中產生了的抗菌素的緣故。以用孢子處理過的輪蟲為飼料發現大比目魚體中幾乎沒有可以復活的細菌。盡管這種處理方式增強了大比目魚幼苗對于病原菌的抵抗力，但是還不能說這就是使用了益生菌的直接作用的結果。在成品使用中，活的乳酸菌也被加入到比目魚幼苗的餌料中。通過這種方法，增加了輪蟲的產量和提高了大比目魚和日本比目魚的生長速度。某些乳酸菌的使用也限制了輪蟲中細菌的增殖，但是在這些研究中并沒有說明乳酸菌的生長情況]。其他一些鏈球菌制品可以提高以色列鯉魚的生長速度和飼料利用率。當在鯉魚養殖中使用益生菌制品十四天后，埃希氏菌屬的大腸桿菌完全從其消化道微生物群中消失了。其開發者宣稱這種制品對鯉魚消化道中的上皮細胞具有很高的附著能力。對于陸生動物使用益生菌的實驗顯示了其在水產養殖飼料中的使用微生物添加劑的重要性，但是，在水生動物腸道內可以存活的微生物群還不是太確定。現在的研究主要著重于從水生動物中尋找其自身的可以作為益生菌的微生物。
5結論
5．1可以在水產養殖中使用益生菌，但是還需要更努力的研究。第一個問題就是益生菌在養殖水體和水生動物腸道中的生長繁殖的情況并不是太清楚，這一點在很多情況下都沒有得到解答。隨著免疫和分子探針的出現，這將為追蹤益生菌細胞提供一種有利的工具。對于益生菌的最好使用方式和最佳的劑量還需要進一步的調查研究，同時也要解決一些技術問題，特別是要保持干藥球中益生菌的活力。
5．2細菌的孢子很容易添加到干燥的餌料中，這也是這些可能的候選益生菌的另一種優勢。乳酸菌和酵母都是很好的選擇對象，應該對它們進行深入的研究。我們應該進行長期的調查研究以確認這些細菌是無害的，而且不會出現任何可能有害的變異這種風險。
第3篇：水產養殖弧菌的處理范文
關鍵詞: 副溶血性弧菌; 檢測; 基因; PCR技術
中圖分類號: S944.4 文獻標識碼: A 文章編號:1009-8631(2010)04-0192-02
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP) 是革蘭氏陰性嗜鹽細菌, 隸屬弧菌科中的弧菌屬的一種人畜共患病菌。最早由Fujino等在1950年從日本1例食物中毒患者排泄物中初次分離得到,本菌呈弧型、桿型、絲狀等多形態,菌體一端有單鞭毛,營養要求不高。副溶血性弧菌主要存在于近海岸的海水、海底沉積物和魚蝦、貝類等海產品中,是引起食源性疾病的主要病原之一。污染了大量該菌而又未經良好加工處理的海產品被人類食用后, 會引發人突發性食物中毒,可導致患者出現腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發燒等典型胃腸炎反應。副溶血性弧菌還可導致海鯛、九孔鮑、斑節蝦、對蝦、牙鲆及文蛤等水產動物致病,間接影響人類的健康。
副溶血性弧菌在含3.5% NaCl培養基中最為適宜,無鹽則不能生長,但當NaCl濃度高于8%時也不能生長。在鹽濃度不適宜的培養基中,細菌呈長桿狀或球桿狀等多形態,無鹽蛋白胨水中生長很差或不生長。在硫代硫酸鈉檸檬酸膽鹽蔗糖培養基(thiosulfate-citrate-bile saltssucrose,TCBS)上副溶血性弧菌形成綠色菌落,能發酵葡萄糖、甘露醇產酸不產氣,不發酵蔗糖和乳糖,分解色氨酸產生靛基質,神奈川試驗(kanawaga phenomenen,KP)陽性。該菌不耐酸,不耐熱,在1%醋酸或50%食醋中1min死亡,90℃1 min即被殺死。在淡水中存活不超過2d,在海水中可存活50d。副溶血性弧菌在普通血平板(含羊、兔或馬等血液)上不溶血或只產生β-溶血。目前研究認為與副溶血性弧菌致病力相關的主要毒力因子為溶血素類,包括耐熱直接溶血素(Thermostable Direct Hemolysin,TDH)、TDH-相關溶血素(TDH-related Hemolysin,TRH)和不耐熱直接溶血素(Thermolabile Hemolysin,TLH)。國家食源性疾病監測網數據顯示,我國微生物性食物中毒的病原分布發生了顯著變化,特別是在沿海省份,副溶血性弧菌引起的食物中毒在發生規模及人群暴露規模呈明顯上升趨勢,已經高居微生物性食物中毒首位。副溶血性弧菌檢測在水產養殖疾病臨床診斷、流行病學調查、食品中微生物檢測、水產品進出口檢測及醫院感染監控等方面有著重要的作用。文章綜述了副溶血性弧菌的各種檢測技術手段。
一、常規方法
副溶血性弧菌的常規檢測方法是傳統的培養和生化鑒定方法。該方法也是目前食品中副溶血性弧菌檢測的國家標準(GB/T 4789.7-2003)及行業標準。該方法是通過細菌形態特征、培養特性、生理生化特征來鑒定,包括培養增菌、分離提純、鏡檢和生化試驗及副溶血性弧菌的特有生化試驗KP現象。具體的是采用氯化鈉結晶紫增菌液進行增菌后、接種于氯化鈉蔗糖瓊脂和選擇性瓊脂平板使包括副溶血性弧菌在內的嗜鹽性弧菌得以分離,可疑菌落經氯化鈉三糖鐵斜面、革蘭氏染色和嗜鹽性實驗進行初步判定,最后經生化試驗以及動物試驗進行確定其是否為副溶血性弧菌,此方法只能定性不能定量。目前廣泛使用的定量檢測方法是FDA細菌分析手冊中的最大可能數方法(Most Probable Number,MPN)。該方法將樣品勻漿后在堿性蛋白胨鹽增菌液(Alkaline peptone water,APW)增菌后,接種于TCBS分離該菌。但是最近Raghunath報道將以前方法改進后用牛磺膽酸鈉培養(Sodium taurocholate,ST broth)檢測海產品中的副溶血性弧菌優于APW法[1]。該方法耗時長,周期需要3~5d左右,操作繁瑣、工作量大、人力物力花費大,給副溶血性弧菌的檢測、研究、進出口貿易帶來不便,不能滿足食品衛生快速反應體系的需要。
二、免疫學檢測技術
(一)免疫酶技術
將抗原抗體的特異性反應與酶的高效催化反應有機結合起來,通過酶降解底物呈現的顏色反應來指示特異性抗體的存在,根據反應顏色的深淺指示抗原量的多少。在多種免疫酶技術中以間接ELISA、雙抗體ELISA以及Dot-ELISA法最為常用。酶聯免疫吸附法(ELISA)與其他檢測方法相比,具有特異性強、敏感性高、檢測時間短、對設備的要求較低等優點,可以在短時間內準確地將副溶血性弧菌檢測出來。已有類似報道集中在實驗室方法探索上,余俊紅等[2]建立間接EI1SA技術快速檢測花鱸的病原菌,用此方法對花鱸組織樣品,包括肌肉、鰓、腸、肝、腎等組織的檢測表明,陽性檢出率為76.1%,特異性較高。竇勇等[3]2008年報道利用間接競爭ELISA法檢測幾種水產動物中副溶血性弧菌,檢測下限為104 cfu/mL,與常規生化培養檢測法對比,常規生化培養無法檢測出的而ELISA 卻可以將其檢測出,檢測時間為8h。對鰻弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及志賀氏菌等幾種常見食品致病菌菌株無交叉反應。李國等[4]將ELISA法應用于文蛤副溶血性弧菌檢測中。但是,若能進一步優化各項反應條件,制備成快速檢測試劑盒,具有較高的實用和推廣價值,必將在水產養殖大量樣品的檢測中發揮重要作用。
(二)免疫熒光技術
免疫熒光技術(Immunofluorescence technique),又稱為熒光抗體技術,是利用某些熒光素通過化學方法與特異性抗體結合制成熒光抗體,熒光抗體與被檢抗原特異性結合后,形成的免疫復合物在一定波長光的激發下可產生熒光,借助熒光顯微鏡可檢測或定位被檢抗原。所用的熒光素標記抗體稱為熒光抗體,常用的熒光素如,異硫氰基熒光素(FITC)、羅丹明(RB200)、綠色熒光蛋白(GFP)等。免疫熒光技術是將免疫化學和血清學的高度特異性和敏感性與顯微術的高度精確性相結合,在水產副溶血性弧菌檢測上有大量的研究報道[5]。
免疫熒光技術的主要特點是:特異性強、速度快、靈敏度高。但也存在缺點: 如非所以特異性染色問題難以完全解決;操作程序較繁瑣;需要特殊的昂貴儀器(熒光顯微鏡);染色標本不能長期保存等。
(三)免疫印跡技術
免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(Western blotting),是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。將含有目標蛋白(抗原)的樣品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或非變性電泳(Native-PAGE)等分離后,通過轉移電泳原位轉印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面,然后將膜表面的蛋白質再用抗原抗體反應進行特異性檢測。例如,將經SDS-PAGE分離的蛋白質帶轉移到膜上后,膜用封閉液處理,然后與第一抗體反應,膜經漂洗后再與偶聯辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸(酯)酶(AP)的第二抗體反應,加人生色底物反應之后,即可顯示出目標蛋白的位置。張曉華等利用Western 印跡法對13 株不同來源的副溶血弧菌的外膜蛋白及其抗原性進行了比較研究,發現它們有相似的SDS-PAGE圖譜,其中一條44ku的免疫反應帶幾乎是所有副溶血弧菌菌株共有的,推測極有可能與副溶血弧菌抗原的特異性有關。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性,其優點是方法簡便、標本可長期保存、結果便于比較,故廣泛應用于分子生物學等領域,成為免疫學、微生物學及其他生命科學常用的一種研究方法。
三、PCR檢測技術
聚合酶鏈式反應(PCR)技術是美國Cetus公司的科學家Mullis于1983年發明的一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。目前,國內外學者已廣泛使用PCR技術研究食品中副溶血性弧菌的快速分型與檢測。PCR技術由于其高度的特異性、敏感性及快速、穩定性好、檢測耗時短等特點在食品中副溶血性弧菌快速檢測方面展現了巨大的潛力。但其缺點是程序復雜,需要精密儀器設備,價格昂貴,不利于在基層推廣應用,且可能出現非特異性擴增產物,假陽性結果。
1999 年,Yamaichi等[6]已經完成副溶血性弧菌的基因組測序,VP的毒力基因序列得到進一步確定。TRH、TDH、TLH及尿素酶是副溶血性弧菌的主要毒力因子,其中TDH是絕大多數副溶血性弧菌具有致病能力的毒力因子,TRH和尿素酶是少數臨床菌株特別是KP-菌株的毒力因子,TRH的毒力與尿素酶的活性有關。TRH與TDH的氨基酸序列有70%同源,編碼這2種毒素的基因trh和tdh的同源性為68.1 %,TRH與TDH的抗原性有部分交叉,兩者免疫原性相似。trh基因據其核酸序列的變化又可分為2 個亞組:trhl和trh2基因,兩者同源性為84%,分別編碼蛋白TRH1和TRH2。目前,建立的副溶血性PCR檢測技術是基于gyrase基因[7]、toxR基因[8,9] 、TLH和TDH[10,11]為靶基因設計引物探針進行檢測。副溶血性弧菌PCR檢測技術有:隨機擴增多態性DNA分析技術、重復序列PCR技術、擴增片段長度多態性分析技術、多重PCR技術、實時PCR(real-time PCR,RT- PCR)等,其中RT- PCR技術近年來在副溶血性弧菌檢測上進行了大量的研究。覃倚瑩等以 toxR基因為靶基因, 通過優化反應條件建立了快速檢測副溶血弧菌的TaqMan實時熒光PCR方法。靈敏度試驗表明, 該方法最少可檢測到25 個拷貝的toxR基因重組質粒, 對純培養物和模擬食品樣品直接檢測的靈敏度分別為21 cfu/mL和210 cfu/g;特異性試驗表明, 該方法能選擇性檢測副溶血弧菌, 而與金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特桿菌等多種常見的食源性病原菌沒有交叉反應;重復性試驗表明同一樣品于試驗內及試驗間的變異系數分別為0.9%和1.3%;結果表明TaqMan實時熒光PCR方法具有特異性好、靈敏度高、重復性好的特點, 能進行定量檢測, 而且檢測時間從核酸抽提到出實驗結果僅需要3h, 是快速檢測副溶血弧菌的有效手段。Tyagi等用SYBR熒光染料建立了熱帶貝類實時熒光PCR方法,最小檢測范圍可以達到0.1 pg副溶血弧菌DNA。Kim等也建立了牡蠣實時熒光PCR方法。
四、小結
除了以上方法外,還有研究報道將核酸分子雜交、變性高效液相色譜技術(DHPLC)、膠體金免疫層析技術、基因芯片技術[16]等技術應用于副溶血性弧菌檢測中。雖然許多學者研究了多種副溶血弧菌檢測技術,但是筆者認為副溶血弧菌檢測產品市場化方面的研究還比較欠缺,許多成果僅停留在實驗室研究階段。目前市場上應用的副溶血性弧菌(VP)核酸擴增檢測試劑盒僅能應用于進出口檢疫、實驗室研究和實驗設備先進的單位,基層養殖戶由于缺乏PCR儀和分子生物學技術無法此法進行檢測。只有研究出適合于基層養殖場的快速粗略僅能定性的檢測試紙條,適用于中層檢測機構效果好交叉反應小的ELISA試劑盒和適用于進出口和實驗設備好的,以中國流行的致病性副溶血弧菌為主的核酸擴增檢測試劑盒才能真正的解決我國副溶血性弧菌檢測市場化問題。
參考文獻:
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第4篇：水產養殖弧菌的處理范文
1.合理和節約用水，保障重點水面用水。
（1）科學調度漁業用水，協調解決各行業用水矛盾。對于兼有灌溉功能的池塘和小型水庫，要積極協調好漁業生產和農業生產的關系，制定科學的用水調度方案，必要時確定最低水位線，避免多重損失；有條件的地區，可采取“過塘水”，即先水過塘、再灌溉農田的辦法，科學調配、充分利用有效的水資源。
（2）加強養殖用水調劑，保障生產正常開展。
干旱引發池塘水體蒸發，造成養殖密度增大，水質惡化，給養殖生產帶來嚴重影響。一是要保障養殖用水。采取筑壩蓄水、疏浚溝渠、引水灌溉、泵站提水、打井抽水等有效辦法，最大限度地調度漁業生產用水，滿足養殖需要。在有條件的地方要大力推行“一塘一井”辦法，保證漁業生產正常進行。
（3）本著科學合理用水，節約用水的原則，適當減少換水頻率，提高水的利用率。對水源條件較好的養殖地段，做好池塘蓄水工作，保持較大的水容量。
（4）搞好池塘、養魚稻田的滲漏檢查和維修工作，發現滲漏情況及時進行修閘堵漏，減少水的浪費。
（5）修復、添置提灌設施，確保必要供水順暢。
（6）要優先保證親魚和魚種池塘的用水。旱情嚴重的地方，應采取并塘或轉移的方法，保存親魚和魚種。并塘或轉移時，要注意操作方法，盡可能減輕對魚體的損傷。運輸時，盡量選擇在傍晚進行。
2.想方設法增加池塘蓄水量，保障養殖生產。
（1）有條件的地方還需要采取臨時性打小型機井提水，組織排灌機械，加注新水，緩解供水矛盾。
（2）加深池塘水位，以改善水質、降低水溫與水體載魚量。
（3）如不能加水，則協調養殖戶之間的關系，對即將干枯的池塘，將苗種集中轉移到水源較好的池塘暫養，待旱情解除后再放回原塘飼養。
（4）網箱養殖區將網箱移至較深水域。
3.充分利用有限水資源，加強水質調控。
（1）控制水位。高溫季節易出現水溫分層、水質惡化現象。故要將水位控制在1.2-1.5米，既有合適的水溫，又可穩定水質。
（2）干旱時期，旱災未解除前，減少投喂量，及時清除殘餌、雜物，保持養殖水體環境良好，減少施肥量，保持良好的水質。
（3）干旱期要清除池內漂浮物，將未腐爛的雜質撈起，以免引起水質惡化。
（4）切忌池塘內堆積綠肥和施用人畜糞尿、各種餅肥等高效有機肥。
（5）隨著氣溫逐漸升高，池水的蒸發嚴重，所以應保證池水溶氧充足，及時開啟增氧機。遇陣雨或悶熱天氣適當延長開機增氧時間，防止發生泛塘。
（6）采用生石灰調節和改善水質。可每隔10-15天，每畝每米水深用生石灰15公斤，化水全池潑灑。
（7）采用微生物制劑調節和改善水質。條件好的地方，可施用EM菌、活水寶、光合細菌、底改凈等有益微生物制劑和底質改良劑來改善水質及底質。
（8）采用生物方法凈化水質和降低水溫。外來水源有限的池塘，在保證基本養殖水位的前提下，可利用池塘面積的10%左右的水面設置浮床，移植種植紅菱、水浮蓮、水葫蘆、空心菜等浮性植物，以凈化水質和降低池水溫度。
（9）備好增氧粉等急救物資，可以在發生嚴重缺氧浮頭、意外停電等情況使用。
（10）加強夜間的巡塘觀察，注意天氣變化，特別是雷陣雨強降溫、強對流可能對養殖魚類引起泛池要做好充分準備。
二、科學投喂技術
在水產養殖生產中，養殖效益的高低，餌料系數是關鍵因素之一。在水產養殖過程中，飼料的費用約占養殖成本的60%以上。飼料的正確使用及效果，將在水產品養殖的過程中起到舉足輕重的作用。只有充分發揮飼料的利用率，降低使用飼料的成本，以較低的餌料系數取得較高的產量，才能取得良好的經濟效益。 針對今年干旱的反常氣候，許多地方缺少水源，魚類食欲減退，生長緩慢。因此我們應加強飼養管理，合理投喂飼料，減少不必要的浪費， 主要采取的措施如下：
1.選擇優質飼料
投喂高質量穩定性好的配合飼料，不投劣質和冰鮮飼料；飼料營養要全面，滿足能量、蛋白質、脂肪、碳水化合物、必需氨基酸、必需脂肪酸、粗纖維及各種礦物質和維生素等需要。特別注重蛋白質營養，對于配合飼料來說，蛋白質是魚類生長所必需的最主要營養物質，蛋白質含量也是魚飼料質量的主要指標。應適當降低放養密度，適當投喂精料，增加蛋白質營養。
2. 合理投飼
旱災未解除前，減少投喂量，加強有氧投喂策略，干旱期間的日投喂量應為正常投喂的70%-80%左右；調整投喂技術，做到早晚各投喂一次，并采用8分飽食投喂方法，減少飼料的浪費和因飼料浪費造成水質污染，保持水質清潔；養殖過程中應及時清除殘餌，保持養殖水體環境良好。
3.加強飼養管理
要堅持“定時、定位、定質、定量”的“四定”原則，要堅持“看水溫、看水質、看大氣、看攝食”的“四看”投餌方法，加強飼養管理。
一是掌握投喂標準，高溫期，日投喂量占魚類總體重的2％～4％，但應防止剩料。
二是區別養殖種類。 合理放養密度，不同種類的魚，在干旱期間其潛在生長能力及生長所需營養要求各不相同，因此其投喂量與投餌料品種也應有區別。
三是把握吃食時間。干旱期間原則上以喂七成飽為佳。選擇定點投喂觀察，一般以投喂后1小時～2小時吃食情況而定。1小時內吃完表明要加料，2小時還沒吃完，要適當減量。如果經過較長時間正規投喂，魚類吃食時間突然減短至2小時，說明魚體已增重，應調整投喂標準。
四是觀看池塘水色。一般肥水呈油綠色或黃褐色，上午水色較淡，下午漸濃。水的透明度在30厘米左右，表明肥度適中，可進行正常投喂；透明度大于40厘米時，水質太瘦應增加投飼量；透明度小于20厘米時，水質過肥，應停止或減少投餌。水質偏酸（pH值在6 . 5以下）應酌量少投飼， 同時每畝水面用2 0 千克生石灰化水全塘潑灑， 將偏酸水質調到微堿性（pH值在7以上）。
五是注意合理操作。投喂注意不可將飼料一次性倒入池中，以免營養成分溶解散失而造成浪費或敗壞水質。投喂飼料及馴化時應把握“慢－快－慢”的節奏和“少－多－少”的投喂量，少量多次，以提高投喂效果。在陰天及梅雨季節等低溶氧時期盡量少投喂或不投喂，以防止泛塘或浪費飼料。
六是注意天氣變化。魚類飼料投喂也應隨天氣的變化而變化。在魚類生長期內天氣正常，每日投喂兩次，一般是上午8-9時， 下午4-5時各投喂一次；天氣晴好，應多投飼，陰雨天少投，大暴雨時不投，天氣悶熱、氣壓低及雷電大雨時不投。
七是加強巡塘，觀察魚體生長情況。在每天早晚巡塘時， 要仔細觀察魚類活動情況，如有輕微浮頭，應減少投飼量；如嚴重浮頭，應停止投喂并及時采取加注新水和增氧措施。定期檢查魚類生長情況調整投飼數量，發現魚類生長沒有達到應有的規格或則個體懸殊較大，應及時調整增加投喂量，補充營養確保其正常生長。
三、病害防控技術
由于今年干旱，造成養殖池塘水位低，養殖品種密度加大，魚類相互之間相互感染病原的機率增加，就會引起魚類抗應激能力下降，造成魚類抗病能力降低，一旦發生病害，傳染速度就會加快，因此要特別防止爆發性魚病的發生。現在的魚病工作一定要貫徹“全面預防，積極治療”的正確方針，采取“無病先防，有病早治”的積極方法，才能達到減少或避免魚類因病死亡，保證養殖魚類的單位面積產量和質量。而且魚病的發生不是一個孤立的原因，它是魚體、病原體和生活環境三者相互作用、錯綜復雜的體現，因此預防魚病不能只從某一方面考慮，而要從三方面著手，既要注意消滅傳染病的來源，盡可能切斷傳染和侵襲途徑，又要提高魚體的抗病力，還要改善生活環境，采取綜合性的預防措施，才能達到預期的防病效果。因此，在魚類養殖過程中，必需創造一個適宜的生態環境，并實施營養素（含營養素藥物）和有益微生物成為優勢種群的調控技術管理，才能使之有利于增強魚類的抗病力而健康成長，而不利于病原微生物的增殖，才能達到病害防控、嚴防病害爆發的技術要求。
1.加強日常管理
干旱期間，是魚類病害高發期，各養殖戶要堅持每日數次巡塘，注重日常管理，密切觀察養殖品種的變化，發現問題，正確應對，巧妙渡過干旱高溫期，減少旱災損失。在每日巡塘中應注意觀察魚群的活動和吃食情況，發現異常現象及時進行魚病檢查和相應的治療。同時，必須貫徹“以防為主，防重于治”的方針，定期對養殖水體潑灑生石灰、微生物水質改良劑，增強魚類抗應激能力，使用刺激性小的消毒劑對水體進行消毒，避免造成養殖水體不穩定，對養殖魚類造成新的應激。
2.加強應激管理
應激（脅迫、緊迫）管理本身是健康養成最核心的技術，在干旱期間更應加強應激管理。爆發性魚類疾病一般都出現在環境惡變，出現應激之后，特別是水質不穩定（水質發生變化）、氣候環境很差、酸堿度變化大及溫差大等應激強度較大時，養殖魚類最容易感染病患。其具體方法可全池潑灑三寶高穩VC（150-250克/畝）、葡萄糖（2-3公斤/畝。米水深）、黃芪多糖（100克/畝），以增強養殖魚類的抗應激能力。并在潑灑這些后4-6小時，應用刺激性小的消毒劑進行消毒（需注意消毒劑的選擇和使用問題），撲殺細菌和病毒，雙管齊下方能最有效控制水產養殖魚類疾病的爆發。
3.加強增氧措施
隨著養殖時間的增加，污物積累使池塘底部異養菌成為優勢菌群，引起池塘底部嚴重缺氧，進而造成亞硝酸鹽、氨氮因氧化不完全而蓄積（發生中毒），二是池底缺氧最嚴重的后果是致病菌-嗜水氣單胞菌的惡性增殖，兼之缺氧已經顯著降低了養殖魚類的免疫力，這樣就極容易爆發疾病。為了把底部污物存量降至最低，溶氧必須達到足夠高，以實現驅除、氧化分解，并為生物降解污物提供廣泛接觸的條件，其中采取最有效的手段就是改善水體循環，消除底部缺氧，其方法是使用底層增氧機和在天氣悶熱、下雨天及平時晚上12-1點全池潑灑以過碳酸鈉為主要成分的片狀增氧劑200-300克/畝。
4.干旱期間在魚類養殖過程中應加強危機管理
在干旱期間養殖魚類的養殖過程中，必須實施危機管理，以創造一個良好的生態環境，并實施營養素（含營養素藥物）和有益微生物成為優勢種群的調控技術，使之有利于增強養殖魚類體質的抗病力而健康成長，而不利于病原微生物的增殖。
環境惡變是養殖業最危險的敵人，通常在氣候變化特別是干旱季節池塘最容易缺氧引起致病菌的大量增殖而爆發疾病。對于病原體（細菌、病毒）爆發的條件是缺氧（低溶氧）和底質污物蓄積（提供病原體營養和病原體），水體載菌（毒）量偏高，對養殖魚類產生應激引起低抗力下降。對于這些因素我們應根據天氣情況和養殖經驗，提前實施危機管理，采取應對措施：
（1）拌喂優質穩定VC（1-2克/公斤飼料），增強養殖魚類抗病和抗應激能力；
（2）增加池底溶氧（半夜使用以過碳酸鈉為主要成分增氧劑200-250克/畝），利于增強養殖魚類活力，不利于細菌（如弧菌、嗜水氣單胞菌等）增殖；
（3）使用刺激性小的消毒劑以殺滅細菌和病毒，有利于保持水質穩定，這是養殖過程中最重要的一點；
（4）降低投餌量，減少殘餌和污物，降低病原菌的營養供給；
（5）若養殖魚類發生病害應立即全池潑灑三寶高穩VC（200克/畝），以提高養殖魚類的抗應激能力，有利于養殖魚類的健康恢復和發揮消毒劑的消毒效果；
（6）如果使用好氧的有益微生物（如硝化細菌、芽孢桿菌等）改良水質，需注意在使用微生物制劑前天晚上每畝用過碳酸鈉為主要成分的片狀增氧劑，并在使用前3-4小時使用一次快速增氧劑并持續開動增氧機，有利于發揮好氧微生物制劑的功效，達到改良養殖水質的效果。
四、苗種補放技術
苗種是水產養殖的基礎，持續干旱影響水產親本和苗種生產，造成苗種供應不足和質量下降，嚴重影響漁業生產，主要表現在如下方面：
1.干旱困擾苗種生產，種苗供應不足。春季是苗種繁殖的季節，由于早春缺水，親魚培育過程中水質條件較差，親魚未經過流水刺激，導致親魚性腺成熟差，懷卵質量下降，繁殖過程中產卵率、受精率、孵化率均呈下降。一些苗種場因缺水處于半生產或未生產狀態，使得部分地區的苗種供應告急。
2.干旱制約種苗投放，養殖周期縮短。冬春季節是漁業干塘整修、水利整險加固和農業生產用水高峰期，干旱造成湖泊水位低，溝渠和塘堰長時間干旱，水源異常緊張，許多地區水產養殖已無水可調，池塘無水或者蓄水嚴重不足，導致不能及時投放魚種，錯過了最佳放養季節，同時也縮短了養殖周期，部分魚池甚至至今都無法投放種苗。
為了應對干旱災害，可從調配親本和苗種資源、合理補充放養、異地或不同品種間的調配、提高生產技術等方面著手，減少災害造成的損失。苗種生產應對干旱災害的技術措施如下：
1.做好親本調配和培育，確保苗種生產供應
（1）查清親本存量。及時查清親本損失數量，根據親本標準及苗種生產計劃，及時補充、調運親本。
（2）強化親本培育。加強親本飼養管理，加強營養，補充能量，促進親本正常發育，確保用于繁育生產的親本數量和質量。
（3）親本異地培育。如果持續干旱導致親本培育水面嚴重萎縮，對于一些能進行轉移的親本，可進行異地租賃水面進行培育，將干旱地區的親本轉移至非干旱地區進行保護和培育，來年再運回當地進行苗種生產。
（4）野生優質親本的利用。對于四大家魚、蝦類等以野生種為主要親本來源的種類，可以從當地或異地湖泊、河流甚至溝渠等野外水域中收集野生親本，進行一定時間的馴養和培育后用于苗種繁殖。
2.做好苗種繁育工作。
（1）改善池塘育苗硬件設施：加固池埂減少滲水量和滲水的重復利用：新開池塘和塌陷嚴重的池埂，滲透水量相對較多，需加寬池埂，并在池埂適當部位開挖深溝，重新填埋泥土，堵住滲水。滲水比較分散的池埂，在池埂外側開挖淺溝，收集池埂滲水。收集的滲水可以用氯制劑消毒后重新注入池塘。水位降低后，葉輪式、水車式增氧機的增氧效果下降，要注意增加開機時間，或配備底層管道增氧設施，達到增加水體溶氧量的目的。
（2）組織專業技術人員，對苗種生產單位和個人，進行育苗技術集中培訓和現場指導，提高苗種繁育技術水平，提高苗種質量，彌補苗種供應不足。
（3）苗種異地培育。對于一些能進行轉移的親本，可進行異地租賃水面進行培育，可將干旱地區的成熟親本轉移至非干旱地區進行苗種繁育， 苗種育成后再運回當地進行放養。
（4）改進苗種捕撈方式，節約用水。有些種類苗種捕撈時，部分傳統的方法是放水收集，水資源浪費大。面對干旱，可改進捕撈方式，盡量以拉網等方式進行，節約用水。
3.做好親本和苗種調劑，補充放養以保證養殖生產需求。
有關管理部分可組織苗種生產單位做好親本和苗種的調劑、調運工作，從異地調運部分苗種補充放養，有些品種也可捕撈部分野生苗種補充放養，抓好苗種的調劑，互通有無，互補不足，以最大限度滿足災后養殖戶對苗種的需求，使廣大養殖戶能夠在災后及時補充投放苗種，將干旱對漁業生產的影響降低到最低限度。
五、抗旱管理技術
1.及時掌握旱情，早安排，早部署。密切注意氣象部門的旱情預報，提前作好應急預案，準備抗旱物資，全面安排部署水產養殖抗旱救災工作。
2.成立技術服務專家組，主動做好技術幫扶工作。也可將專家組成員名單、聯絡方法通過各種方式告之養殖戶，保證養殖戶得到及時的技術指導。
3.增強水產品質量安全意識，從水域環境監控、產地環境、投入品、生產過程、市場準入等環節加大水產品質量安全監管力度。建立《水產養殖生產記錄》《水產養殖用藥記錄》和《水產品銷售記錄》，加強水產投入品監管和水產品檢疫，嚴禁使用違禁藥物，確保水產品質量安全。
4.加強生產管理，適當減少養殖密度，科學投喂。旱情嚴重的地方，應及時將商品魚捕撈上市或采取并塘、轉移等措施，降低養殖密度，緩解水體溶氧壓力。并塘或轉移時，要注意操作方法，盡可能減輕對魚體的損傷，盡量選擇在傍晚進行。對于不能上市的魚種作好并塘或囤積處理，確保不能上市的魚種安全度過干旱。適當減少每天投喂次數和投喂總量，盡量不施有機肥、少施無機肥。
5.加強水質調控和疫病防控，確保水產品質量安全。要求每天增加巡塘次數，注意日常管理，密切養殖品種的變化。干旱期要經常清除池塘內的漂浮物，將未腐爛的雜質撈掉，以免引起水質惡化。加強病害監測，加大疫病防治，指導漁民科學用藥，發現問題，及時應對。
6.及時修復養殖設施，做好苗種準備工作。對已干枯的池塘，及時清除淤泥、消毒塘體，修補塘埂和溝渠，做好旱情緩解后恢復生產準備工作。做好苗種儲備供應和信息調度，組織干旱程度較輕的地區加大水產苗種生產力度，及時水產苗種供需信息，為恢復生產做好準備。
第5篇：水產養殖弧菌的處理范文
通訊作者：李偉，男，教授，Tel: 0411-84763553；E-mail: aisingioro@hotmail.com。
韓歡，徐婧，孔亮，李偉*，董美玲，劉琪，王春龍
（大連海洋大學，遼寧 大連 116023）
摘要：對水產品等食品中磺胺類抗生素常用的分析方法和預處理方法進行了綜述，歸納和比較了毛細管電泳法、微生物方法、液相色譜-質譜法、免疫法、氣相色譜法、分光光度法、高效液相色譜法等特點。其中高效液相色譜法由于操作簡便、快速、靈敏、準確的特點，是當前檢測磺胺類抗生素的主要方法。同時，對包括固相萃取、分子印跡等預處理方法進行了綜述。
關鍵詞 ：磺胺類抗生素；抗生素殘留分析；高效液相色譜法；分子印跡。
早在人類出現之前，細菌已經在不同的生態位發揮著重要的作用。在細菌中有相當小的比例是致病菌，它們能夠給人類和動物的健康帶來災難性的影響。在治療細菌感染的歷史過程中，人類就發現了細菌和植物種類中有益的抗菌性，并開始利用具有抗菌活性的化合物來抑制細菌感染，而這些化合物大多是來自自然界。1929年，弗萊明在實驗中偶然發現了青霉素，并且在牛津大學病理學教授弗洛里的進一步系統研究之后，抗生素的發展得到了大力推動[1]。青霉素在首次臨床試驗中，療效效果十分驚人，從此抗生素進行大規模生產及商品化使用，并且在畜牧、水產品養殖等行業大面積使用。但隨著抗生素商品化及平民化使用，過度及搭配不當地使用抗生素反而會危及人及動物的生命安全，同時也會造成環境污染。如：產生毒副作用[2]、致病菌產生耐藥性[3]、繼發性感染[4]、動物源性耐藥菌對人類的危害[5]、影響環境微生物[6]、食品安全[7]。
1磺胺類藥物殘留的檢測分析方法
磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是比較常見的合成抗菌劑，普遍用于漁業養殖生產，主要有：磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine，SM1）、磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SM2）、磺胺甲基異惡唑（Sulfamethoxazole，SMZ）等。它們主要用于治療魚類的赤皮病、腸炎、鏈球菌病、弧菌病、細菌性豎鱗病、赤鰭病、爛鰓病、鞭毛蟲病、弧菌病、腸炎等等[8-9]。SAs的廣泛應用，使魚病的感染和傳染方面得到了有效的控制。但是人們在享受著抗生素帶給人們方便的同時，許多新的問題也伴隨而來。像毒性反應、二重感染以及細菌產生耐藥性等，尤其是在濫用的情況下能夠產生排尿和造血紊亂等副作用[10]。因此大多數國家包括我國農業部、日本、歐盟、歐美和國際食品法典委員會（CAC）等都陸續規定了食品以及飼料中SAs的最大殘留限量標準[11-12]。其中日本規定SM1為0.02 mg/kg，磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）為0.04 mg/kg，SM2為0.01 mg/kg，其它按一律標準為0.01 mg/kg[13]。聯合國食品法典委員會（CAC）、歐盟和歐美等國家規定水產品中磺胺類藥物殘留量不得超過0.1 mg/kg[14]。 我國農業行業標準《NY 5070—無公害食品水產品中漁 藥殘留限量》中規定，SAs在水產品組織中的最高殘留總量限量為100 μg/kg。另外我國檢測SAs標準還有SN0221-92，SN0208-93，GB/T20759-2006等。
目前，SAs殘留的檢測方法很多，主要有微生物方法、高效液相色譜法（HPLC）、毛細管電泳法、液相色譜-質譜法(HPLC-MS)、免疫法、氣相色譜法（GC）、分光光度法等。其中高效液相色譜法簡便、快速、靈敏、準確的特點是當前檢測SAs的主要方法。表1為近年來常用的抗生素分析方法。
1.1微生物方法
微生物方法是應用較為廣泛的一種檢測方法，尤其是在牛乳中抗生素殘留的檢測。微生物檢測方法分為紙片法、亮黑還原法、TTC法、CHARM抑制法等[15]。該方法具有可直觀、儀器設備成本和檢測成本較低，但該方法的靈敏度和特異性與其它方法對比相對較低。其中酶標抗體檢測法是目前一種趨向靈敏、準確、快速的新型微生物檢測方法[16]。
1.2高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）
高效液相色譜法（HPLC）是色譜法中一個重要的分支，也是目前應用最廣泛的檢測抗生素的方法。HPLC因載液流速快，固定相和流動相可以自主選擇，所以具有分析速度快、分離效率高的特點，可以檢測近70%的化合物。抗生素殘留在色譜分析時最常用的檢測方式有紫外-可見檢測器（UV-Vis）電化學檢測器（ECD）、熒光檢測器（FLD）和二極管陣列全波長檢測器（DAD）等。如劉勇[17]、ayas-Blanco[18]、Kunihiro Kishida[19]、方炳虎[20]等分別應用反相高效液相色譜法檢測分析牛奶中SAs的殘留，并采用乙腈提取SAs殘留，獲得了良好的分析效果。劉振偉等[21]以乙腈進行提取，HLB小柱凈化，采用紫外-可見檢測器在270 nm處進行檢測，檢測低限能夠達到5 μg/kg，線性在25～300 μg/kg范圍內良好。該類方法具有準確度高、精密度好、檢測限低的特點。
1.3毛細管電泳法（Capillary Electrophoresis，CE）
毛細管電泳法也是一種液相分離的技術，再用紫外-可見檢測器掃描成電泳譜圖，相對于高效液相色譜來說，CE的柱效更高，對于離子型化合物具有很好的分離效果，并提高了樣品檢測的分辨率。目前由于毛細管電泳和高靈敏度檢測器的聯用，靈敏度有了極大的提高[22-25]。如Ackermans等建立了毛細管帶電泳法檢測磺胺噻唑（Sulfathiazole，ST）、磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole，SMO）等15種SAs的殘留分析方法[26]。但CE最大的不足是進樣量過低，造成分析誤差升高，并且進樣的待測物受到限制，很難應用于痕量分析。
1.4液相色譜-質譜法(HPLC-MS)
液相色譜-質譜法是液相色譜作為分離系統，質譜作為檢測系統的一種結合方法。液質聯用技術是色譜和質譜優勢的互補，提高了對復雜樣品的分離分析能力。HPLC-MS有如下幾個特點：（1）分析范圍廣泛，可以檢測絕大多數的化合物；（2）分離能力強，通過MS，能夠按照特征離子質量可以將色譜中沒有徹底分開的混合物進一步進行分離，并可以定性、定量分析；（3）檢測限低；（4）分析時間快；（5）自動化程度高。如Casetta等建立了HPLC-MS/MS法測定了蜂蜜中SAs的方法[27]。
1.5免疫學方法
免疫分析方法包括放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）、酶聯免疫分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）、固相免疫傳感器、免疫親和色譜（Immunoaffinity Chromatography，ICA）等。免疫學方法具有操作簡便、分析成本低、靈敏度極高等優點。其中酶聯免疫分析法更是由于特異性強、操作簡便的特點使其成為最為常用的方法之一[28-30]。但由于免疫測定法大多數是以生物物質作為分子檢測識別原件，這些物質不易長期保存，并且操作穩定性差，容易出現假陽性，因此不適合作為確證試驗。
1.6氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）
氣相色譜在早期SAs分析中應用較多。GC可以使用的檢測器通常有火焰電離檢測器（FID）、電子捕獲檢測器（ECD）、熱導檢測器（TCD）等。其中FID、TCD檢測的范圍廣泛，其它的檢測器因檢測化合物的范圍較窄而鮮有應用。GC具有分析速度快、效率高、操作簡單、選擇性較好、低檢測限等優點。由于GC/ECD可以作為GC/MS的補充可以測定動物性食品等樣品[31]，所以分析SAs時氣相色譜法主要為GC/ECD。但同時GC只能適用于低沸點、易揮發但不分解的物質進行定性和定量分析，因此在很多實際分析檢測中，GC受到了一定的限制，需要對樣品預處理、色譜條件、流動相的選擇進行改善等優化。
1.7分光光度法
分光光度法有紫外可見分光光度計、原子熒光分光光度計和原子吸收分光光度計，同樣它們在食品領域中已經得到了廣泛的應用[32-33]。雖然常規的光譜學儀器應用廣泛、操作簡便等優點，但受到線性范圍、準確度及精密性等性能參數的制約，從而影響到解決食品中實際樣品檢測問題。Gala B等建立了停止與流動技術與T型熒光分光法結合的方法同時測定出牛奶中氨芐青霉素和四環素[34]。
表1常用的抗生素分析方法
2針對抗生素分析的樣品預處理方法
由于食品中富含脂肪、蛋白質、糖、維生素及氨基酸等基質，而且食品中存在大量的干擾物質，待測物含量非常低，規定的濃度量級基本為mg/kg、μg/kg、ng/kg，甚至更低。因此在檢測食品樣品中需要大量而且細致的分離純化和富集過程。樣品預處理是其中必不可少的步驟，也是最關鍵的步驟。由于樣品預處理可以減少雜質對目標物的干擾程度，以及可以對試樣中的痕量組分進行預富集，所以是整個檢測分析過程中誤差的主要來源和分析時間快慢的決定步驟[35]。預富集能力越強、富集成分越單一，檢測靈敏度就越高。而且無論是HPLC還是GC等的檢測方法通常是需要對樣品中的抗生素殘留進行預處理，如分離、純化等步驟。因此，發展新型快速的樣品預處理方法對于建立食品中抗生素的檢測方法也是非常重要的。目前磺胺類抗生素檢測分析樣品預處理方法主要有液-液萃取法、固相萃取法、微波輔助萃取法、超臨界流體萃取、分子印記法等。表2為近年來常用的抗生素分析的樣品預處理方法。
2.1液-液萃取
液-液萃取是SAs殘留分析中的一種常用的經典提取方法，是早期樣品凈化方法中最常用的方法，一般應用于樣品中被測物質與基質的分離。其原理是根據組分在溶劑中的不同溶解度而達到分離或提取目標化合物的目的。張偉紅等先將水產品酸化處理，再用乙腈做萃取溶劑，經正己烷脫脂后，蒸發濃縮，最后用HPLC-MS/MS內標法測定了水產品中18種SAs殘留量[36]。液-液萃取方法雖然操作簡便，但是存在處理過程引起的誤差較大、可控性較差等不足，除雜效果有限。
2.2固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）
固相萃取主要應用于樣品的分離、濃縮和純化。固相萃取方法具有如下優點：(1) 富集倍數高，由于使用的是固相萃取柱富集樣品，所以富集倍數可以高達數十倍，甚至是數百倍；(2) 分離雜質效率高，固相萃取可以有針對性地選擇SPE吸附劑，從而有效地分離干擾組分；(3) 有機溶劑消耗量低，僅需少量的洗脫劑就能把待測分析組分洗脫下來；(4)易于收集、操作快捷方便等優點，因此目前廣泛應用于食品化學成分、農獸藥殘留、環境污染物等方面的檢測。
SPE可以根據抗生素化學性質采用不同類型的SPE柱進行固相萃取。其中，用于分析動物源性食品中SAs的SPE柱主要分以下幾種：(1) C18 SPE柱；包艷萍等采用C18 SPE柱凈化蔬菜中SAs，凈化效果良好，回收率為50.80%～98?90%[37]。(2) 堿性氧化鋁SPE柱；王欽暉等、李俊鎖等分別在測定蜂蜜、雞肝組織中SAs殘留量時，采用堿性氧化鋁SPE-Pak柱凈化樣品，樣品用乙腈淋洗后售價并分析，結果表明干擾被測樣品中的雜質能夠被去除，該方法操作簡單[31,38]。 (3) Oasis HLB SPE柱；李存等將樣品加入到Oasis HLB SPE柱中進行分離預處理，結果表明，該預處理方法去除雜質效果較好，定量曲線線性良好[39]。(4) Oasis MCX SPE柱；熊芳等采用Oasis MCX SPE柱對動物肝臟中的4種SAs進行萃取[40]。該方法操作簡便，凈化效果好，能夠滿足分析的需要。(5) 硅膠SPE柱；董丹等采用硅膠SPE柱對雞肉中的17種SAs進行凈化，方法回收率為52.30%～124.90%，提高了樣品中被測物質的檢測靈敏度[41]。(6) DVB型全自動固相萃取小柱；何桂花等運用全自動固相萃取小柱富集凈化動物臟器組織中的SAs。使用二氯甲烷提取，正己烷除脂。萃取柱經甲醇和5%的乙酸溶液處理活化，然后上樣，采用5%的乙酸-甲醇(1:1, v/v)進行洗脫收集后進行分析，結果表明處理效果較好[42]。由于SPE具有效率高、重復性好、處理速度快等特點，目前已經成為抗生素殘留分析預處理方法的一個發展方向。
2.3微波輔助萃取（Microwave Aided Extraction，MAE）
MAE具有回收率高、萃取時間較短等優點，其具體表現為：不僅可以加快樣品中基質、大分子物質的分離，還可以通過添加極性溶劑吸收微波能來提高溶劑的提取效能；MAE能夠在高溫和高壓下加快分子運動速度，繼而提高了微波萃取的速率。曾慶磊建立了微波輔助水蒸氣萃取的方法提取動物飼料中磺胺類抗生素，能夠快速、高效率地提取飼料中磺胺類抗生素，并減少了樣品中其他雜質的提取，達到了較高的回收率[43]。
2.4超臨界流體萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）
當某一物質高于本身的臨界溫度和壓力后，該物質物理狀態處于既不會是液體也不是氣體的狀態，我們稱之為超臨界流體（Supercritical Fluid，SF）。SF由于其獨特的性質而能夠溶解很多物質，SFE正式利用這一超臨界流體作為溶劑，因此壓力和溫度都會對流體的溶解能力產生很大的影響。并且SF的表面張力較小，使其能夠快速滲透到樣品中，因此其萃取速度要比普通溶劑的萃取速度快很多。由于這些性質使超SFE要比溶液萃取的效果好得多[44]。SFE具有廣泛的實用性、萃取效率高，尤其是不產生污染、節省能源等優點，特別適合于熱敏性天然產物和生理活性物質的萃取分離[45]。
2.5免疫親和色譜法（Immunoaffinity chromatography，IAC）
免疫親和色譜法是一種操作簡便、分離效果理想且精密度高的樣品前處理中方法。IAC有可以對復雜基質中痕量組分進行選擇性吸附和富集的特點，檢測線非常低，而且免疫吸附柱經適當處理后可以重復使用，目前是殘留分析中比較有效的凈化方法之一，已經被應用于多種藥物殘留的測定。李俊鎖等、Sheth H B等分別建立了免疫親和色譜法測定獸藥和蜂蜜中SAs的殘留[46-47]。
2.6分子印跡法（Molecular Imprinting）
表2抗生素分析中常用的樣品預處理方法
分子印跡技術最早是由Pauling提出以抗原為模板合成抗體的理論為啟發[48]，直到1972年由德國Wulff等研究小組才人工合成出對糖類化合物具有較高選擇的共價型分子印跡聚合物[49]。到1993年Mosbach等在Nature上發表了非共價型分子印跡聚合物合成及其仿生免疫分析應用的文章后[50]，分子印跡技術得到了迅猛發展。分子印跡技術通常來講是指通過加入模板分子能夠形成對某一特定的分子具有特異性選擇的聚合物，并且當模板分子去除后，聚合物中形成與模板分子空間結構相匹配的空穴，從而這個空穴對模板分子具有高度的選擇識別性。分子印跡技術具有構效預定性（predetermination）、特異識別性（specific recognition）、廣泛實用性（practicability）、穩定性好、使用壽命長等特點[51]。在以磺胺類作為模板分子的整體柱報道中，劉祥軍等以SMO作為模板分子，四乙烯基吡啶（4-vinyl pyridine，4-Vpy）為功能單體，采用了原位聚合法在色譜柱中直接制備了SMO分子印跡整體柱，并顯示出良好的識別能力。
中國加入世界貿易組織之后，各國政府使用貿易保護政策來維護本國的經濟利益，而食品安全問題已經成為影響貿易的關鍵因素，各國對食品中SAs的殘留量制定了嚴格的控制標準。近年來，由于水產養殖病害多發，不規范用藥情況依然存在。另外，由于水產養殖的集約化，飼料藥物添加劑和亞治療量的各類抗生素在生產中廣泛應用，以及不合理用藥等因素，使水產品藥物殘留問題日益突出。我國由于出口產品SAs殘留超標，造成了外貿受阻，給我國的經濟和形象帶來了嚴重影響。因此無論是從產品的本身需求方面，還是為相關法規和標準的執行提供科學技術依據，提高并完善檢測包括水產品在內的食品中SAs殘留的技術都是至關重要的。
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第6篇：水產養殖弧菌的處理范文
關鍵詞：寡糖；提取；純化；應用
中圖分類號：S646.099文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）07-0141-05
寡糖又稱低聚糖，由不同的五碳糖和六碳糖通過糖苷鍵連接形成。科學界對“寡”的數目并沒有嚴格的規定。1959年，Jhone建議將9個以下的單糖殘基低聚物稱為寡糖[1]。寡糖及其衍生物是一類重要的生物活性物質，能促進雙歧桿菌生長，激活植物的自我防衛系統，還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用。寡糖類物質可通過天然提取、降解和人工合成等方法獲得，其中天然提取的方法具有方法簡單、能耗小、污染低等優點。玄參科、菊科植物和食藥用菌因其含有較多的功能性寡糖和未知寡糖，已成為天然寡糖的主要研究對象。食藥用菌含有的聚糖類物質尤為豐富，繼活性多糖后食藥用菌寡糖的研究將成為糖工程研究的又一熱點。
1寡糖的分布
寡糖類物質的分布廣泛，多數植物的根莖、果實和種子中均含量豐富。王照波等[2]、王江浪等[3]從雪蓮果、蘋果中提取出大量寡糖類物質，陳[4]采用水提醇沉去多糖法從洋根中提取的低聚果糖含量高達53.72%。生地黃中已知的寡糖種類有水蘇糖、棉子糖、甘露三糖、毛蕊四糖等[5，6]。據報道，營養豐富的食藥用菌也富含寡糖類物質。姜瑞芝等[7，8]從猴頭菌浸膏中分離得到猴頭菌二糖、三糖和四糖。馬紅霞等[9]從樹舌靈芝中分離得到了非還原性二糖。此外，也有從藻類、菊芋、大豆等[10～12]植物中獲得寡糖類物質的報道。
2寡糖的分類
到目前為止已確定的寡糖有上千種。寡糖的分類有以下3種方法[13]：①根據寡糖的單糖組成可分為同寡糖和雜寡糖；②根據寡糖分子中是否存在游離的半縮醛羥基，分為還原性寡糖和非還原性寡糖；③根據生物學功能可分為普通寡糖和功能性寡糖，前者可被機體消化吸收，產生能量，后者具有特殊的生理學功能但不被腸道吸收。此外，寡糖還存在許多經過化學基團修飾生成的衍生物，如糖醛酸、胺基糖、脫氧糖、糖醇等[14]。
3天然寡糖的提取方法
天然提取寡糖與降解或合成寡糖的方法相比，雖不易擴大到工業化生產，但工藝簡便，涉及化學藥品少，對寡糖的結構及生物學活性影響小，有利于研究未曾發現或認知的新型寡糖。常見的提取方法有以下幾種：
3.1水提法
水提法是自天然材料中提取糖類物質的常用方法。為了減少雜質，可先用低極性溶劑去除親脂性的成分，然后再用水浸提。趙貴興等[12]以脫脂豆粕為原料，采用水提法制備大豆低聚糖漿，為大豆的綜合利用提供了新途徑。
3.2有機溶劑抽提法
糖類是多羥基的化合物，極性大，易溶于極性溶劑，因此，可利用相似相容原理，選擇合適極性的溶劑反復抽提。趙益斌等[15]對青陽參乙酸乙酯提取物進行研究，分離得到4種新寡糖。信維平[16]分析了乙醇甲醇法和乙醇法兩種提取方法對胡蘿卜寡糖提取率的影響并確定了最佳提取工藝。
3.3微波提取法
近幾年來，微波提取法已廣泛應用于藥用植物化學成分提取方面。其原理[18，19]是利用微波能的加熱效應加速對目標化合物的提取，并利用空間電場和磁場的高頻振蕩，加速目標化合物的擴散速率，從而提高提取效率。王章存等[19]利用500 W的微波在近中性的條件下處理30 min，可顯著提高大豆低聚糖的含量且更利于脫鹽。
3.4射頻法
與微波加熱同屬介電加熱的射頻技術，射頻頻率在10～300 MHz，由于其波長最多可達微波波長的360倍，穿透深度（幾十厘米）遠遠超過微波[20]。同時由于射頻的能量更加集中，不像微波是漫散射，因此設備放大后也不存在泄露問題。高虹等[21]探討了射頻技術在香菇多糖提取中的應用，優化了射頻輔助提取工藝，與傳統方法相比得率有較大提高。
3.5超聲波提取法
超聲波法提取糖類化合物的主要原理是由于超聲波產生的空化效應能產生強大的沖擊波，促使細胞內含物釋放到溶劑中，從而加速了整個萃取過程[22]。劉立洋等[23]探究了超聲波技術在提取大豆低聚糖工藝中的應用效果，并摸索出一整套提取、檢測的方法。
4寡糖的分離和純化
寡糖的分離和純化是寡糖研究的關鍵步驟，是指將不同種類寡糖進行分離，得到單一寡糖的過程。目前，常用的分離技術有以下幾種：
4.1層析技術
4.1.1薄層層析薄層層析是在紙層析的基礎上發展起來的，在玻璃板上涂一層支持劑，通過流動劑的推動使一端樣品得到分離的物理方法。常用的支持劑有硅膠G、氧化鋁、纖維素、硅藻土、交聯葡聚糖凝膠等[24]。此方法優點是分辨效率高，簡便易行，可同時分析多個樣品。Betty等[25，26]確定了殼寡糖的薄層色譜分析條件：乙酸乙酯∶乙醇∶水∶氨水（V/V）=5∶4∶4∶0.3，殼寡糖溶液上行展距為8 cm。
4.1.2色譜柱分離法色譜柱分離法是一種便于工業化生產、操作簡單的方法。當樣品溶液通過色譜柱中的固定相后，不同組分即可得到分離。色譜柱中的填充料以離子交換樹脂、大孔樹脂和聚酰胺為主。下面簡單介紹幾種色譜柱分離方法：
①活性炭柱層析：活性炭柱層析是利用樣品中各組分在活性炭上的吸附能力不同來進行分離的。活性炭比表面積大，吸附量大，分離效果較高，與等量的天然硅藻土混合使用，是分離寡糖液常用的填充材料。活性炭柱層析方法的優點是分離容量大，分離效率高，適用范圍廣，并不受洗脫液組成、糖液濃度改變（1%～10%）或無機鹽存在的影響[27]。車今智等[28]采用活性炭柱層析對芙蓉菊寡糖進行分離，獲得了不同分子量的寡糖片段。
②凝膠柱層析法：凝膠柱層析法已廣泛應用在寡糖的分離與純化過程中，其優點是高效、易操作、重復性好。主要原理是利用立體網狀結構的多孔性凝膠作為篩子，如葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex G）、聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio-Gel P系列）等。當糖溶液流經凝膠柱后，洗脫時不同相對分子質量的糖可以得到分離。小分子糖易于擴散，洗脫時路徑長，后被洗下。郝林華[29]采用SePhadexG-50葡聚糖凝膠柱層析分離純化牛蒡寡糖，得率為77.12%。Harry等[30]采用Bio-Gel P-2凝膠柱層析技術分離得到帶阿拉伯糖基的低聚木糖。
③離子交換色譜法：在纖維素層析成功分離糖類的基礎上，人們將纖維素改性，使離子交換與纖維素層析結合制成一系列的離子交換纖維素，應用于糖類的分離并取得了較滿意的效果。常見的陽離子交換纖維素有CM-Cellulose、P-Cellulose等；陰離子纖維素有DEAE- Cellulose、ECTEOLA- Cellulose等，可以分離酸性、中性多糖和黏多糖。用離子交換樹脂分離糖類，可有效地除去樣液中的酸、堿成分及無機離子，但應注意不宜用強堿性與強酸性樹脂[1]。劉元召[31]在研究真菌壁寡糖的過程中，采用強陽離子交換層析介質分離寡糖、蛋白及肽類物質。
4.2膜分離技術
膜分離是利用半透膜作為選擇障礙層，依據膜孔徑大小達到分離目的的一門新技術，其優點是操作簡便、產物活性高和生產過程無污染等。膜分離技術可分為以下幾種：反滲透、透析、電滲析、納濾、超濾、微濾等，其中反滲透和納膜過濾最有望用于分離純化功能性寡糖[32]。杜昱光等[33]建立了一種酶解殼聚糖與膜分離偶合生產殼寡糖的方法。陳勉等[34]采用超濾的方法制備出聚合度為6～8的殼寡糖。
4.3其它分離方法
紙色譜、紙電泳、氣相色譜、石墨化碳柱高壓液相色譜[35]、高效毛細管電泳法[36]等技術也常用于檢測和分離寡糖。隨著各項分離、分析檢測技術的日趨成熟，各種方法間的混合使用已成為研究寡糖的最新趨勢。
5寡糖生物活性的應用
5.1寡糖在農作物抗病方面的應用
寡糖既可自身抑菌抗病，又可作為誘導子誘導植物體提高抗病性，與此同時還可作為營養成分調節作物生長發育[37]，從而提高農作物的產量及商品性狀。許多報道顯示，寡糖類物質對多種真菌性病害均有很好的防治作用[38～42]。徐大明等[43]發現殼寡糖液濃度在0.5×10-5μg/ml以內時，對煙草花葉病毒（TMV）有明顯的鈍化作用。
5.2寡糖在飼料業中的應用
寡糖類物質具有調節腸道微生態、促進雙歧桿菌生長、提高動物的免疫能力及生產性能、避免耐藥性等功效[44，45]。憑借獨特的生物學活性，寡糖類物質已成為新型飼料添加劑研發的熱點。邢廣林、李啟琳等[46，47]的研究結果顯示甘露寡糖能夠代替抗生素藥物添加到飼料中，提高肉雞抗氧化能力、成活率和日增重，降低料重比。王彬等[48]研究顯示，育肥期基礎日糧添加0.1%的半乳甘露寡糖，可以顯著促進育肥豬的生長，減少育肥豬的采食量，增強機體的免疫力。陳麗等[49]研究發現褐藻寡糖對嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、白色念珠菌（Candida albicans）和鰻弧菌（Vibrio anguillarum）3種水產致病菌有很好的抗性，是一種高效、無毒副作用的水產養殖用飼料添加劑。
5.3寡糖在醫療保健方面的應用
5.3.1降血糖、血脂作用寡糖降血糖、血脂的生物活性已成為研發的新方向。據報道[50，51]，地黃寡糖具有降低ALX糖尿病大鼠血糖、增加血清胰島素濃度及肝糖原含量的作用，昆布寡糖對2型糖尿病大鼠具有明顯的治療作用。張婷婷等[52]試驗發現，5～10 ku的甲殼低聚糖對油脂、脫氧膽酸鈉、牛磺膽酸鈉和膽固醇的吸附率分別為5.3%、90.0%、71.1%和87.5%。
5.3.2提高免疫能力寡糖可通過多種途徑提高生物體免疫力，如促進細胞免疫和體液免疫。據報道[53，54]，甘露寡糖能夠提高大西洋鲇嗜中性粒細胞的吞噬活性，對環磷酰胺制造的免疫低下小鼠也有較好的提高免疫力功效。此外，許多寡糖還具有增強造血功能、抗腫瘤、抗抑郁、治療心血管疾病的功效[55～57]。
5.4寡糖在果蔬保鮮方面的應用
寡糖類物質在果蔬保鮮上的應用近幾年屢見不鮮[58，59]，其主要的作用機理有以下幾點：①在果蔬外形成半透膜，減少蒸騰作用造成的水分損失；②起到類似于氣調包裝的效果，維持較高的CO2、較低的O2和乙烯濃度；③阻止存儲果蔬期間糖分和含酸量的下降；④降低存儲期間果實的脂氧合酶（LDX）的活力，防止細胞的脂膜過氧化及內容物的滲漏；⑤通過提高果蔬中超氧化物歧化酶（SOD）的活力，延緩細胞衰老；⑥通過誘導一系列防御反應機制阻礙病原菌侵襲，如堵塞皮孔、產生植保素、果實細胞壁加厚等。鄧麗莉等[60]研究發現1.5%殼寡糖處理可以有效延長柑桔貯藏時間。
5.5寡糖在食品加工方面的應用
某些寡糖具有低甜度、較好的水活性、保濕性、穩定性以及黏度等特點，已被廣泛應用于食品和飲料加工。李曉東等[61]研究表明添加大豆低聚糖可延長點心面包的保質期。金橋等[62]研究發現在傳統酸菜腌漬過程中添加殼寡糖可以有效抑制發酵初期腐敗菌的生長并且還能提高酸菜的感官質量。此外，寡糖類物質應用于乳品、新鮮奶酪及保健飲料中的報道也不少[63～65]。
6結論與展望
隨著人們對寡糖各方面性質和生理功能的不斷認識，寡糖的應用已在食品、醫藥、農業等領域取得了一些成績。食藥用菌卓越的保健功效與其含有豐富的聚糖類物質是分不開的。目前，食藥用菌多聚糖已開展了廣泛研究，但在寡糖類物質上的研究，尤其是天然寡糖的提取研究還較少。因此食藥用菌寡聚糖的研究開發對進一步提高食藥用菌的綜合開發價值有著重要意義。隨著各種自動化分析儀器、現代醫學與糖化學研究的緊密結合，寡糖類物質的研究開發具有廣闊的前景。
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