果蠅培養實驗注意事項分析

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【摘要】果蠅作為一種重要的模式生物，分布廣、易獲得、生活史短、遺傳變異易于檢測，適于實驗室研究。本文在簡要分析果蠅實驗室培養傳統方法的基礎上，從瓶塞制作、問題處理和管理方法等方面對果蠅培養實驗中的注意事項進行了探析。

【關鍵詞】果蠅；培養；實驗

果蠅原產于美洲,是完全變態發育的昆蟲。果蠅的發育要經過卵、幼蟲、蛹、成蟲等幾個時期，從卵到成蟲只要10d左右，一年可以繁殖30代，在實驗室中卻常常出現生長遲緩甚至停滯、繁殖緩慢等問題，對實驗進程帶來不利影響。為保證實驗如期取得成果，果蠅在實驗室中的保種和繁育技術顯得十分重要。

1果蠅的基礎培養

1.1培養基的配置

果蠅的培養基有很多種。經典常用的果蠅培養基的配方為：瓊脂4.5g、玉米粉24g、酵母粉48g、葡萄糖66g、1g/ml尼泊金甲酯9ml、補水60ml。高境鴻等的研究發現使用活酵母培養基可以大大提高果蠅的平均壽命，縮短果蠅發育周期[1]。但在使用過程中，活酵母培養基容易腐爛變質，散發異味，或培養基底部出現氣體將整個培養基床抬高，對果蠅發育空間造成影響。實驗室應根據對果蠅研究的具體需要來選擇合適的培養基。培養基配制時要不斷攪拌，使培養基成分均勻，同時避免因局部溫度過高而燒焦培養基。將培養基煮至微沸后冷卻20min，分裝至高溫滅菌后的果蠅瓶(高10cm、瓶底直徑6cm、瓶口直徑4cm的圓錐體)或者果蠅管(高9.5cm、直徑2.5cm的圓柱體)中[2]，如果使用培養管，每管內培養基高度不超過2cm，等待培養基冷卻凝固，且果蠅管內壁無可見水滴時，用高溫滅菌的瓶塞塞住瓶口。將需要培養的果蠅導入管內，或者于4℃冰箱中保存。4℃保存時間不能過長(不超過一個月)，防止培養基腐爛或被污染。

1.2傳統的果蠅培養方法

果蠅的正常可生存溫度在12℃～32℃。25℃是果蠅生長發育和繁殖最適的溫度。在此溫度下，果蠅的生長發育速度較快，適合進行果蠅的雜交和擴繁等操作。在18℃時果蠅的生長發育和繁殖速度會明顯減慢,此溫度條件下需要進行果蠅的保種。過高或過低都會造成果蠅的死亡，實驗室中應該使用設備控制合適的溫度，確保果蠅按需要生長。每天光照9h為宜，根據培養溫度不同，每間隔2-3周更換一次培養基，在需要大量實驗材料的情況下可以選擇擴大培養瓶體積、數量，或間隔更短時間更換培養基，以滿足實驗需要。更換培養基、繁育果蠅時，把羽化的果蠅20個左右,雌雄數目大致相等的成蟲移入新的培養基里。

2果蠅培養中應注意的問題

2.1無菌處理

使用高壓蒸汽滅菌鍋（121℃20min）將實驗所用培養瓶、瓶塞、微量移液器槍頭滅菌，操作前將試驗臺使用75%酒精殺菌消毒，挑蠅板應在更換不同培養基培養的果蠅前用75%酒精消毒。2.2合適的濕度相對濕度是果蠅生存實驗中的重要因素，相對濕度過高或過低,都會對果蠅的生長發育造成影響。最適宜果蠅生長的相對濕度為50%左右。培養環境的濕度過高會使培養基發霉，導致培養基變黑、污染、無法使用。培養環境的濕度過低會使培養基變干，使果蠅不能產卵,也無法獲取需要的營養。

2.3恰當的瓶塞

培養管所使用的瓶塞應具有良好的透氣性。如透氣性不佳，培養一段時間后會出現瓶內相對濕度過高、發霉、氧氣不足等不適于果蠅生長發育的環境。帶小透氣孔的橡膠塞透氣性差，容易造成上述這種不利情況。主要原因在于，這種瓶塞的透氣孔容易被污染物堵塞，且因其透氣孔很小，清理極其困難，使用一段時間后將出現嚴重的透氣不良的狀況。比較合適的瓶塞是用棉花制作內芯（要求棉量適中，不可過硬，難以塞入住瓶口或不透氣。也不可過軟,否則容易產生縫隙使瓶內果蠅飛出），外面用紗布包裹纏繞，細線扎口，制成稍大于培養管瓶口大小的瓶塞。這種瓶塞使用壽命長、長時間使用也不易損壞、透氣性好、牢固又不與玻璃瓶口粘連，且價格低廉。不足之處是制作相對麻煩。現在實驗室中常用的海綿塞經過多次高溫滅菌后容易變硬變小、長時間使用后質地變脆、貼合在培養瓶玻璃上難以除去、使用壽命過短且價格偏高，性價比過低等缺點，同時具有市場供應充足，且使用方便，透氣性、手感良好等優點。如實驗室有足夠的經濟條件，使用這種瓶塞更加節省時間。除了以上介紹的這兩種瓶塞之外，還有發泡棉制成的瓶塞，這種瓶塞成本較低，但孔洞較大，非常容易變形，且容易與瓶身綁材粘連，脫去綁材時非常容易從瓶口脫出，造成培養瓶內果蠅逃逸。

2.4良好的麻醉效果

在果蠅的麻醉過程中，最忌諱麻醉致死。致死情況包括以下幾種：1）麻醉劑過量致死。2）因為操作不當，果蠅粘在培養基上，復蘇后因無法擺脫培養基的粘附致死。3）麻醉過程中果蠅飛出，為避免污染試驗環境而被人為處理致死。對于以上三種情況，在無特殊要求的前提下可以使用CO2（氣體）麻醉法麻醉果蠅，具體操作方法如下：先將果蠅培養瓶橫放，用充滿二氧化碳氣體的注射針管的針頭插入瓶塞與培養瓶間的縫隙，緩慢推動活塞，將氣體注入培養瓶，直至瓶內果蠅全部被麻醉。該方法可以有效避免使用傳統乙醚麻醉產生的操作失誤致死和乙醚引起人體產生的不適；也可以最大程度的防止果蠅飛出，保證實驗材料的質量、安全和潔凈。為了使用方便，也可以將針管替換為二氧化碳罐，連接軟管和槍頭，在使用時減少瓶塞與培養管壁之間的縫隙避免未被完全麻醉的果蠅從縫隙中飛出。在使用槍頭時也要注意控制氣流速度，防止果蠅在麻醉過程中被氣流沖出，造成材料損失。

2.5即時處理培養基問題

培養基是果蠅在實驗室中生長發育的基礎。當出現以下情況時，無論培養時間多久，都應當立即更換培養基：1）培養基變色。果蠅培養期間可能出現培養基失去本來的顏色而變為紅色、黑色等等，這種情況下應當更換培養基。2）培養基上長出霉菌，或瓶塞上長出霉菌。此時不僅應當更換培養基，也應當清洗瓶塞。霉菌孢子漂浮于培養瓶的整個空間,包括果蠅身上,如將此果蠅接種到新的培養基中,在4-5d后，新接種的培養基同樣會長出霉菌。遇到該問題,不能再接種在發霉培養基中生長的果蠅,重新接種未長霉的果蠅。此外，還可以用周伯春的方法[3]，采取措施殺死果蠅身上的霉菌孢子，將帶有霉菌孢子的成蠅倒入空培養瓶中。具體操作步驟為：棉塞上倒適量的75%酒精,再將瓶口塞緊,利用酒精具有揮發性,揮發后的酒精充滿整個瓶內,從而將果蠅身上的霉孢子殺死。要注意：一是倒在棉塞上的酒精量要適量,過多果蠅易醉昏,過少殺不死霉菌孢子;二是果蠅呆在空瓶內的時間要恰當,以2d為好。3）培養基過干或過濕。出現這種情況，培養基充足的情況下可以更換培養基，也可以用王轉斌的方法[4]來處理。4）培養基內的果蠅幼蟲蟲體變細小，變透明。這種情況應當考慮是病毒感染或者培養基成分問題，應當收集已經羽化的成蟲并更換培養基批次。

2.6得當的管理方法

果蠅房機械化程度低，人工管理成本較高。果蠅的培養在一定溫度下具有很強的周期性，使用日期歸類可以更高效的管理實驗室和培育實驗材料。不同日期的培養批次按照更換培養基或接種的培養日期分類放置。在進行更換培養瓶或培養基的操作時，可以根據日期分類管理培養瓶。培養實驗材料時同樣根據日期批次來收取成蠅，這種方法可以控制收取到的成蠅所處的生理周期為實驗最適，也同時管理了不同生理周期的果蠅批次。按照日期批次記錄和管理，可以大大提高實驗室管理效率，減少工作量。

3結語

為保證實驗室果蠅正常培養繁育，需要正確的培養基配比、控制溫度、控制光照。特別要注意實驗前各種器具的無菌化處理，保持合適的濕度，選用恰當的瓶塞，達到良好的麻醉效果，即時處理培養基問題，采取得當的管理方法，從而高效優質的得到實驗結果。

參考文獻

[1]高境鴻,崔超杰,李俊玲.不同培養基配方對果蠅生長的影響[J].生物技術世界,2015(11):280.

[2]王霞,喬歡歡,潘麗霞等.果蠅新品系開發與種質資源保存[J].實驗動物科學,2016(3):412.

[3]周伯春,汪珍春.培養果蠅三齡幼蟲的小技巧[J].生物學通報,2012,47(3):61.

[4]王轉斌.果蠅的保種技巧及唾液腺染色體的制備[J].實驗技術與管理,2002(3):37-39.

作者：尹佳寧 單位：濟南大學生物科學與技術學院