正向遺傳學克隆基因的方法精選(九篇)

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第1篇：正向遺傳學克隆基因的方法范文

目前世界上。在應用高新技術的生物工程上開展了劇烈的競爭，誰先掌握到最新資源、最高技術和最優品種的成果，就有可能壟斷一定的市場。在農林業方面，競爭的焦點主要集中在種子上。有科學家預言。在這場“種子戰爭”中。或許可以利用一種資源、一個品種而在種子戰爭中稱雄于世；進而指出.一個基因就有可能影響到一個國家或地區的興衰。但我國在林木種子新技術革命上，起步較晚，基礎比較薄弱，應該加強這方面的研究，期望在林木種子革命中有所突破。為林業現代化作出新貢獻。

1 林木種子革命的背景和意義

70年代以來，世界上提出“綠色革命”的口號，其實質是指種子革命。應該說綠色革命首先是從農業開始的。世界人口的爆炸帶來糧食的緊缺，建設的需要使耕地越來越少，迫使人們必須加快研究選育和推廣應用優良的農作物新品種，及其配套改革栽培管理技術。使作物單位面積的產量越來越高，以解決人類的吃飯問題。隨著現代社會的發展，資源短缺以及環境惡化的矛盾日益突出，世界的生態平衡受到破壞，人類的生存受到威脅。此時，人們不僅要考慮吃飯問題，還要考慮生存及可持續發展等問題。因此“綠色革命”從農業延伸到林業等學科。

森林是地球上生態系統中最重要的因素。人們對森林的認識已從單純索取木材轉變到可持續經營的角度上來，提出分類經營思想，即把森林區分為生態林與商品林來經營。用80％～90％的林地建設生態林，采用復層林作業，其主要作用是保護生態環境；把條件較好的10％～20％的林地用于商品林建設，進行高度集約經營，主要用于向人們提供木材等林產品。例如。新西蘭的商品林僅占其森林總面積的8％.但提供木材占其總產量的90％以上。其關鍵的技術是林木種子的革命。我們用“革命”這個字眼。是因為良種對林業生產力起著決定性作用，它的變革是根本性的，可帶來翻翻的產量。是現代林業的一個核心技術。

國內外通過林木種子改良取得明顯效益的事例，不勝枚舉。桉樹原產澳大利亞等地，引進巴西后，經過改良，采用無性系營造商品林，5年生時，樹高可達25m，7～8年即可砍伐更新，每公頃蓄積量超過600m3。剛果進行的桉樹育種計劃取得的遺傳增益為：種源選擇50％-80％ ；雜交、個體選擇、無性系增益100％～150％。

以上事例可以說明，林木良種化帶來的效益是十分明顯的。林木與農作物有所不同，樹木多為異花授粉，多數處于野生或半野生狀態，大部分林木是未經過改良的原始材料。它們的變異普遍，變異的性狀多、幅度大，蘊藏著大量尚未利用的優良變異類型。這些優良類型一旦被選育出來，就可以顯著地提高林業的生產力，加上多數林木具有容易進行基因型“克隆”的特性，一經選擇，馬上采用無性繁殖，大量復制，就可很快投入到林業生產實踐中。

林業上選育良種與農業比較，具有更加經濟長效的優點，在生產周期中只需采用一次，即能獲得長久的效果。農業上一個品種不行，第二年甚至第二季就可換一個。而林木生長周期長，一粒種子播下后，十幾年或幾十年才能砍伐，如果選用良種，年年可獲取增益。從這個意義上看，林木良種選育具有更為迫切的意義。

2 林木品種改良的途徑

2.1 林木遺傳改良的一般過程

林木遺傳改良的形式多種多樣，可以用如下圖式表達其一般過程：

(1)基本群體表型選擇優良類型

(2)優良類型遺傳測定原種

(3)原種良種繁育品種

(4)品種區域化測定良種

可見一個新品種的培育過程經歷了選擇——測定——繁育——推廣等過程，極為精細復雜，需要耗費大量的時間和經費。

2.2 種質資源開發利用

樹木基因資源是地球人的寶貴財富，也是選育樹木優良品種的物質基礎。不論是常規育種，還是誘變育種乃至遺傳工程研究，都離不開基因資源。實踐證明，搜集的基因資源越豐富、越全面，對它們研究得越深入、越有針對性，就越能滿足各種育種目標的要求，選育出人們所期望的新品種。同時，基因資源不僅用于當前的育種，而且要為將來培育更高質量的新品種服務。

據分類學家估計，全世界現有植物5O多萬種，高等植物23萬多種。經人類長期馴化栽培，提供人類吃、穿、用等方面的植物種類，只不過1％～2％。約有2000多種。常見栽培作物只有175種，其中16種提供了人類食物的2／3。正是這些為數不多的栽培種類，成為人類社會物質文明的重要基礎。譬如樹木中的三倍體山楊、直干藍桉等都是從野生林分中發現的快速生長的優良單株。因此，從某種意義上講，基因資源的收集和保存比創造新品種更為重要，是一項具有戰略意義的工作 。

2.3 選擇育種

選擇育種是獲得優良品種和生產群體的重要手段，在林木改良中具有極其重要的意義。選擇育種可以在較短時間內，得到人們需要的基因型，經過繁育馬上就可投入到生產之中。例如筆者在天然馬尾松林中發現紅心率達8O％以上的馬尾松單株，這類馬尾松1996年的價格是3000元／m3，為普通馬尾松的5倍。

選擇的物質基礎是所研究材料的變異，材料的變異越大，變異越豐富，選擇的效果越好。以往林業上多用天然變異，從野生樹木中，篩選符合人們愿望的類型，通過培育為新品種。這種利用天然變異材料仍不失為林木選育新品種的有效途徑。但天然變異畢竟有它的局限性，難于滿足社會發展的需求。于是人們又創造了人工的變異方法，以擴大變異范圍和增加選擇機會，成為直接改良品種的有力手段。如19世紀已開始的樹木雜交育種，通過不同種質問的有性雜交，使父本母本的基因進行交換重組，產生變異。這種方法不僅可以使雜交親本雙方的性狀互補，取長補短。而且可能出現超過親本的性狀，產生原來親本所沒有表現出來的新性狀?，F已從種內雜交發展到種間雜交。進入2O世紀以來，人工促進遺傳變異的技術得到很大的發展。7O年代以前主要用物理和化學因素來誘發植物體的遺傳物質發生變異.使基因突變的頻率比自然界自發突變高出100～1000倍。但這種誘變的方向和性質不易控制，選種的效率較低，因此進展不快。6O年代以來.植物的生物技術發展得很快，從器官培養到細胞培養、原生質體培養、體細胞雜交等，直到現在的細胞工程、染色體工程、基因工程，新技術、新成果不斷涌現，給林業帶來革命性的變化。

2.4 遺傳測定

在目前樹木育種工作中，處理的育種材料多數屬于未經遺傳鑒定的表現型。表現型是樹木遺傳性與環境條件相互作用的結果.所以優良的表現型并不等于它的遺傳性優良。只有經過遺傳測定，認定優良的經濟性狀受遺傳控制，從屬于優良的遺傳性，才能作為原種，進入到更高一級的育種階段。

2.5 林木良種繁育

良種繁育是林木良種化中重要的環節之一。當通過表型測定選育出來的品種.經過區域化試驗，確定推廣地區后，便要做好良種的繁育工作，直至該品種被更換了為止。良種繁育是育種工作的繼續，是前承育種后接推廣并不斷提高種性的一個重要環節。如果繁育措施不當.使良種變為劣種，就會失去它的增產效益。良種繁育不僅是前一輪育種成果進入生產的唯一手段，而且也是下一輪育種所需要的遺傳信息和基礎材料獲得的來源。

目前林木良種主要采用有性和無性兩種形式進行繁育。營建無性系種子園是有性繁育的主要方式，它的營建技術較簡單，繁殖系數較大，被廣泛采用。其實質是通過選擇.改良原有群體的基因的頻率，提高其正向選擇的遺傳增益，達到改良的目的。目前種子園主要的問題是產量低，實生種子的遺傳基礎不一致，對高度集約的商品林來說，木材以及林產品的不一致性，給利用帶來困難。在無性繁殖的情況下，無性系分株的遺傳成分與其原株的完全相同，它們不僅繼承了原株的加性效應，而且繼承了原株的顯性和上位作用效應。所以在選擇差相同的情況下，能取得較大的遺傳增益，因此近代國內外都趨向于無性系育種和無性系林業。

總之，林木種子從原來的見種就采、見苗就種的局面，到現在選擇優良種源、優良林分、優良家系、優良無性系，建立種子園與采穗圃生產良種，已經大大地向前邁進了一步。它已發揮出明顯的作用，產生了巨大的效益。從某種意義上說，已經開始了林木種子的革命。但這還不夠，現代科技的發展，還要求我們加快生物技術應用的步伐，開展更深層次的林木種子新技術革命。

3 生物技術與林木種子革命

近年來生物技術發展迅速.它包括細胞工程、染色體工程和基因工程。

3.1 細胞工程

細胞工程主要包括原生質體培養、大規模的工廠化的細胞培養、組織培養和快速繁殖等技術，以生產大量的優良無性系，并可獲得人類所需要的多種代謝物質，如黃連素、人參皂甙等。細胞融合，它可打破種屬間的界限，在樹木新品種的培育上有著巨大的潛力。目前，胚胎分化人工種子等技術的利用也日益普及。

3.1.1 林木的組織培養

樹木組織和細胞培養的研究也取得了重要的進展。目前由體細胞再生出完整植株的有：歐洲樺、檸檬桉、巨桉、楊樹、花旗松、長葉松、杉木、柳杉等幾十種樹種。林木原生質體培養及細胞雜交也進行了探索，歐洲云杉、花旗松、火炬松、短葉松、楊樹、泡桐等樹種已分離出原生質體，并進行了培養。日本對楊樹種和泡桐的原生質體做了融合試驗。

用組織培養繁殖樹木，不僅和無性繁殖一樣，能保持樹木的優良性狀，同時還具有如下特點：(1)繁殖系數大；(2)縮短良種的推廣周期；(3)培養無菌苗；(4)繁殖難于用常規方法營養繁殖的樹種；(5)發育階段返青；(6)可作用保有基因資源的一種手段；(7)變異培養無性系利用啕。

3.1.2 胚胎發生及人工種子

器官與胚胎發生是培養植物細胞分化的兩種主要途徑。用胚狀體形成植株主要特點是增殖迅速、遺傳單一。在組培中獲得胚狀體以后用適當方法加以包裹即可制成人工種子。根據Flick和Ammirato(1983)統計，經胚胎發生途徑得到完整植株的植物有91種。其中有火炬松、糖松和挪威云杉獲得體細胞胚胎及小苗。我國培育成功的樹木體細胞胚胎發生及小苗形成是中國科學院于1988年以華北云杉(Picea wilsomii)為試材研究成功的。人工種子研制的關鍵是選擇適當的方式進行包被.最常見的是凝膠法包裹。隨著人工種子研究的深入.將有愈來愈多的人工種皮材料被開發出來。

3.1.3 原生質體培養

自從Cocking在1960年用纖維素分解植物細胞壁首獲原生質體以來，在原生質體培養和融合方面已取得突破性進展。國內外約有2O種林木獲得原生質體，其中一部分已誘導成植株。

3.1.4 體細胞融合

體細胞融合試驗應在誘導原生質體再生植株的基礎上進行。體細胞融合方法對于樹木改良特別適合.該法與常規有性雜交比較，具備以下特點：(1)能形成兩個親緣關系較遠的種間雜種，克服了有性雜交的配子不親合性；(2)能獲得一些含有另一親本非整倍體的雜種或胞質雜種；(3)能設計出一次兩個以上親本的融合；(4)能獲得在遺傳上呈雙親個體基因型總和的雜種；(5)能獲得一些有性生殖障礙的植物種類的體細胞雜種；(6)能獲得具有不同遺傳變化親本的雜種。

3.2 染色體技術

染色體技術在樹木的核型、組型、帶型分析的基礎性研究較為深入。速生豐產樹種杉木、楊樹、馬尾松等既有常規的細胞學研究，也有地理種源的染色體性狀比較。經濟林樹種山茶、油茶、漆樹、桑樹、獼猴挑等染色體研究資料也較為深入，藥用植物杜仲、銀杏等有一定的研究。染色體研究在科以上的有杉科、松科、芍藥科、銀杏、山茶科等；地域性染色體資源研究有云南、廣西、寧夏、貴州等地。這些基礎性研究為保護植物種質資源，研究樹種的分類、分化、系統發育提供了詳實的細胞學材料。

3.3 基因工程

樹木基因工程取得的進展及其作用主要有：

3.3.1 DNA分離與轉導

基因工程的一個最關鍵技術是把目的基因轉導到目標植物中去，并使其能準確地表達出來。8O年代初.人類首次從細菌中分離出來一些分解抗生素的基因，成功地轉移到植物細胞中，并獲得能在含抗生素的培養基上生長的植株。此后即出現了一系列轉基因植株。同時轉基因技術也日益成熟。目前林木轉基因技術有不少成功的事例：

(1)抗蟲轉基因植株。1988年美國依阿華大學林學系利用從馬鈴薯中提取的蛋白酶抑制劑Ⅱ號(InhibitorⅡ)為目的基因，與以新霉素磷酸轉移酶Ⅱ(NoemycinphosphotransteraseⅡ，即N Ⅱ)為標記基因制成嵌合基因，以根癌農桿菌 grobacteriumtumefeciens)的Ti質粒為載體，以葉盤轉化再生法(Leaf disk transf~lrmation regeneration me山ed)為組培手段，用楊樹雜種無性系(Popuius albaxPopulus grandidentata)為試材，經測定這種抗蟲的轉基因植株具有高毒性，幼蟲取食后死亡率很高。

(2)抗除草劑轉基因植株。1987年美國加州和威斯康星州的科學家利用楊樹雜種無性系(alba.xP.grandidentata)為試材，從土壤中沙門氏細菌(Salmenella bacteria)提取抗除草劑的DNA.這種基因能控制一種特殊的酶，它能解除除草劑的作用，而對沙門氏菌安全。經培養獲得除草劑轉基因植株。

(3)通過基因操作控制木素的生物合成。在生產紙槳的過程中，為除去不需要的木素需要大量的能源，處理木素廢液還要龐大的設備，于是就產生了培育木素含量少或易提取木素林木的想法。有人用“反意法”研究培育木素含量少的林木。另一項試驗是把合成闊葉樹型木素的基因導入針葉樹，培育含有大量易提取木素結構的林木。

(4)抗大氣污染氣體的林木的培育。其重點在活性氧解毒上起重要作用的谷胱甘肽還原酶的基因上。有報告指出，把出自大腸桿菌的基因導入雜種楊，培育提高此種酶活性的轉化體。在一般情況下，林木對大氣污染物質也有很強的吸收和解毒能力。而此種酶活性進一步提高的轉化體，作環境綠化木是大有可能的，它具有很強的耐SO：和臭氧的性質。

(5)控制林木形態的形成。對控制柳杉花形態形成的基因和變應原基因進行了分離.利用這些基因培育出能控制產生雄花和合成變應原的柳杉。有報告說：把白葶藶的控制芽分化的基因導入雜種楊，得到了花芽形成時間由通常的8年縮短到僅7個月的轉化體。

(6)通過基因操作擴大林木的生育范圍。一般來說，植物生長發育的場所是不能變動的，個體或種的維持是靠與光照條件、大氣成分、土壤水分、土壤養分、有害物質的吸收、病原菌的感染等環境條件相應的復雜的適應機制。例如，若能對平時出現過剩的基因進行操作。這種基因是控制耐干燥、耐鹽基因群的基因，那么，影響出現前轉化體就有防御機制，其結果就擴大了生長范圍。如果耐凍性、耐寒性、耐高溫性、抗紫外線性等受到重視，那么控制林木生長范圍(南限和北限、海拔高度界限等)的基因操作就會成功。

3.3.2 林木遺傳圖譜的構建

遺傳圖譜是選用合適的自然群體或通過人工技術手段構建的人工作圖群體，利用各類遺傳標記和定位的基因構建的遺傳標記與基因的線性排列圖。林木遺傳圖譜是對林木基因組進行系統研究的基礎。由于林木生育周期長，利用形態標記來構建遺傳圖譜幾乎不可能，所以過去幾乎找不到林木遺傳圖譜。由于同工酶技術的發展，7O-8O年代構建了一部分樹種的同工酶標記的遺傳圖譜。但同工酶利用的標記有限。難以構建高密度的遺傳圖譜。由于分子標記的開發，近年林木遺傳圖譜構建已成為林木遺傳學研究的熱點，有利于在短期內構建高密度的圖譜。共顯性以分子標記如RFLP、SSR、STS等適合于任何作物群體的遺傳作圖；而顯性標記如RAPD只適合于單株針葉樹構成的群體(因其來自親本的單倍體胚乳)和DH群體。利用大量分子標記構筑高密度連鎖圖后，有利于今后未知基因的定位、克隆及分子標記輔助選擇等。

3.3.3 目標基因定位和克隆

利用已有的遺傳圖譜及適當的分離群體可以將目標基因或數量性狀座位(Quantitative TraitLoci。簡稱QTL)定位于某條染色體的某一區段或每兩個遺傳標記之間。這些被定位的主基因或QTL可利用位置克隆的辦法被分離克隆，一些作物的有用基因如水稻白葉枯病抗性基因Xa2 ，就是這樣被克隆到的。

數量遺傳學作為遺傳學的一個分支一直是獨立發展的。但到8O年代卻處于低谷。由于分子生物學的崛起，分子標記的開發，數量遺傳和分子生物學的結合產生了新的邊緣學科——分子數量遺傳學，使得數量遺傳學重新獲得新生。因為利用分子標記對QTL的定位，可象一般主基因那樣將QTL克隆出來加以利用。這對林木遺傳育種將產生重大影響。因為許多經濟性狀都是由QTL控制的。

3.3.4 分子標記輔助選擇育種

分子標記輔助選擇(Maker Assisted Selec—tion。簡稱MAS)。是通過分析與目標基因緊密連鎖的分子標記的基因型來判斷目標基因是否存在的一種植物育種選擇方法。這種方法不受其它基因效應和環境因素的影響，因此結果較可靠，而且可以進行早期選擇和對隱性基因的選擇，從而大大加快育種進程。提高選擇效果。特別對于生育周期長的林木來說更具有重要意義。

3.3.5 物種、品種及優良無性系鑒別

不同物種、品種及單株在基因組上均存在差異，不同植株(不同無性系)之間的差異在多數情況下是難以鑒別出來的。但由于分子標記的無限性，總可以將其區分開來。因此分子標記可非常有效地用于林木育種特別是優良無性系的鑒別，還可用于物種、品種分類。利用分子標記可以檢測出林木種子園外來其它花粉的污染情況，也可鑒定其生產的種子是否真由種子園親本之間雜交產生，以檢測種子的混雜性。

3.3.6 在林木基因研究上的應用

林木的生理現象還有很多是未知的，用基因結構和機能加以說明是驗證科學世界的要求。例如把控制形態形成的基因導入鉆天楊并出現過剩。那么就會改變葉的形態，或者節間變短或者短化。因此我們認為，這種基因有調節葉的形態、節間長短和樹高的可能性?？傊虿僮骺煞Q作是解析未知的基因機能的重要技術。林木研究方面也在尋求開發組織特異的或生長階段特異的促進劑。我們在世界上率先對與裸子植物光合作用有關的基因的促進劑結構與機能進行了解析。分析基因促進劑時。要求在促進劑范圍內讓信使基因連結。向基因分離了的該生物種類基因轉移，通過信使基因的出現，分析促進劑的機能。

3.3.7 在林木染色體組研究上的應用

對人及實驗動植物的染色體組研究正在蓬勃開展。為了推進林木的染色體組研究，用DNA限制酶斷片多型分析，成功地編制了柳杉連鎖圖。對部分連鎖群來說。利用三體生物能使其處于與特定染色體相對應的狀態。該連鎖圖將向未來高密度連鎖圖發展。與11條染色體的對應及染色體上的基因配置也能得到理解，作為有關柳杉染色體組的結構與機能的基礎信息將會起重要作用。

第2篇：正向遺傳學克隆基因的方法范文

摘要:

種質資源又稱遺傳資源，其不僅是進行農業科技原始創新以及現代種業發展的物質基礎，更是保障糧食安全、建設生態文明并實現農業可持續發展的戰略性資源。本文從種質資源的收集、鑒定和評價、創制及利用等方面進行了綜述，以期為分子育種時代的種質資源創新和利用工作提供可利用的信息。

關鍵詞:

分子育種;種質資源;創新;利用

種質資源又稱遺傳資源，是進行新品種選育的基礎材料。古老的地方品種、重要的遺傳材料、野生近緣植物以及利用上述繁殖材料人工創造的各種植物的遺傳材料，都屬于種質資源的范疇。就作物而言，種質資源不僅是進行農業科技原始創新以及現代種業發展的物質基礎，更是保障糧食安全、建設生態文明、實現農業可持續發展的戰略性資源。種質資源的核心是其所攜帶的基因，對優異基因進行挖掘和充分利用可使農業生產取得突破性進展，舉世聞名的第一次“綠色革命”就源于小麥和水稻中矮稈基因的發現和應用［1］。長期以來，我國作物種質資源工作的重點一直停留在收集、保存與鑒定等方面，導致具有廣泛應用前景的高產、優質、多抗、高效等關鍵功能基因的發掘與利用滯后，突破性新種質匱乏以及特有基因資源流失嚴重等問題。根據《國家中長期科學和技術發展規劃綱要》精神，從國家科技發展總體布局出發，結合經濟發展和國家安全需求，在現代生物技術高速發展的時代背景下，作物種質資源的工作重心將轉向其優異基因資源發掘與種質創新，包括高產、優質、抗生物及非生物逆境、水肥高效利用等基因資源，在明確其功能和應用價值的基礎上，創造一批可直接用于育種的中間材料。最新公布的七大作物育種專項也將優異種質資源鑒定與利用作為各項工作的重中之重。本文對我國種質資源的收集、鑒定和評價、創制及利用現狀等方面進行了綜述，以期為作物種質資源的創新和利用工作提供可利用的信息。

1種質資源的收集

種質資源的收集是一個很古老的話題。作為作物種質資源大國，長期以來，我國政府和科學家也一直非常重視作物種質資源的收集工作。自20世紀50年代以來，不僅先后組織了多次農作物種質資源征集和考察工作，而且在保存設施建設方面也加大了投入，挽救了一大批瀕臨滅絕的地方品種和野生近緣種及其特色資源，建立了完善的種質資源保護體系［2］。2015年，農業部、發展改革委和科技部聯合印發了關于《全國農作物種質資源保護與利用中長期發展規劃(2015—2030年)》的通知，深入分析了在現代農作物種業發展過程中我國目前農作物種質資源保護與利用工作存在的問題，嚴密部署了第3次全國農作物種質資源普查與收集行動，并就實施過程提出了詳細的技術規范。

2種質資源的鑒定與評價

目前我國編入全國作物種質資源目錄的材料約48萬余份，躍居世界第2位［3］。如何對數以萬計的種質資源進行精準評價，從中發掘出優異基因并將其應用于現代化育種工作，是現階段我國進行種質資源收集的最主要的目標之一，也是亟待解決的科學問題之一。在對種質資源進行廣泛收集和考察的基礎上，我國相關研究人員也對所保存的資源進行了基本農藝性狀的鑒定，并進行了綜合評價。而這些基于不同年份、不同地點的調查所進行的評價，由于以易受環境影響的表型特征為依據，同時受研究條件和研究方法的制約，不能全方位、多層次地展開，因此精度有限。與表型鑒定相比，基于DNA序列多態性的分子標記則能在DNA水平上揭示種質間的不同，不受環境及發育時期等因素影響，而且具有較高的穩定性和可重復性，從而成為進行種質資源的鑒定和評價的一個更直接、高效且可信的工具?，F階段，我們應重點基于分子標記進行種質資源的DNA指紋分析、遺傳多樣性分析、核心種質構建以及功能基因的鑒定和評價等。

2.1DNA指紋分析

DNA指紋分析是分析并比較任何生物體之間DNA序列的非常快速的方法，該方法已被廣泛且有效地用于種質資源的管理。目前，用于指紋識別的分子標記有簡單重復序列或微衛星、SCoT、抗性基因同源序列、SNP等多種類型。這些分子標記大多為單位點，符合孟德爾遺傳規律，而且多態性高、信息量豐富。隨著測序技術的不斷發展，基于高通量測序的基因型檢測方法也逐漸成為研究熱點之一。

2.2遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是生物多樣性的核心問題，是種質資源研究的重要方向。物種內或物種間的遺傳多樣性可以表現在多個層次上，如分子、細胞和個體等，遺傳多樣性是物種保持進化潛能的基本條件。近年來，遺傳多樣性的研究發展迅速，新的理論和方法不斷產生、發展和完善?；诜肿訕擞浀倪z傳多樣性分析可直接用于指導育種實踐，例如利用分子標記技術對作物種質資源的群體結構與遺傳多樣性進行分析，可以幫助育種家更有目的地選擇雜組親本，提高育種效率。

2.3核心種質構建

對資源的廣泛征集和不斷累積交換使得種質資源越來越多，但數量的增加并不意味著遺傳變異也得到相應增加，因為資源庫中可能含有較大比例的遺傳冗余甚至重復的材料。這就為我們種質資源工作了提出一個新的問題，就是如何對數目龐大的種質資源進行評價和有效利用，“核心種質”這一概念的提出為這一問題提供了解決辦法。構建核心種質是提高種質資源利用效率、提升種質創新能力的基礎。另外，核心種質本質就是一個基因庫，在作物優質單元型區段(或基因)的發掘過程中也具有廣泛的應用價值。近年來，作物遺傳資源核心種質的構建越來越受到學者的關注。目前，我國已構建了水稻、小麥、玉米、大豆等幾大作物的核心種質庫。在國家973項目的資助下，我國科學家還開展了水稻、小麥和大豆核心種質重要農藝性狀單元型區段及互作研究，該項工作也將為以上作物的分子設計育種和遺傳轉化育種提供基因資源，為未來重要基因的合理布局提供科學依據。

3種質資源的創新

種質資源創新的過程，就是對現有種質資源中所包含的遺傳信息采取某種手段或方法進行改變的過程，傳統意義上的雜交育種就是種質創新的一種最基本和常用的途徑。隨著人們對生物體認識的不斷深入以及生物技術的不斷發展，種質資源創新的方法也不僅僅停留和局限于通過雜交來進行，還在組織、細胞乃至分子水平上進行。創新途徑主要包括誘變、染色體工程技術、小孢子培養、原生質體融合基因工程等。近化手段、生物技術的興起也極大地提高了人們創造和利用變異的能力，為種質創新提供了多種可利用的手段。突變體庫的建立和篩選也是基因挖掘的重要基礎。國際上已構建了4個大規模水稻插入突變體庫。通過60Co－γ射線照射、甲基磺酸乙酯(EMS)誘變等技術，各國科學家也創制了多個水稻、玉米、小麥、大豆等主要作物的突變體庫［4］。單倍體育種技術是近來發展成熟的、基于小孢子培養、花藥培養等組織培養技術的育種方法，它是對植物單核晚期的花粉進行培養，誘導其形成胚狀體，并通過染色體人工或自然加倍產生純合的二倍體或多倍體植株的過程。該方法可快速獲得大量純合、穩定的雙、單倍體再生植株，為保存和創造作物種質資源提供了一條有效途徑。轉基因技術的發展則實現了不同物種間基因的交流。轉基因育種就是根據育種目標，利用現代生物技術從供體生物中分離目的基因，經DNA重組和遺傳轉化將其導入受體作物，經過篩選獲得穩定表達的重組單株，最終結合大田選擇和田間試驗培育新品種或新種質的過程。該技術可以突破物種間的遺傳障礙，大跨度地超越物種間的不親和性，從而打破了遺傳物質分類上的界限，實現了基因在不同物種間的轉移，大大拓寬了作物遺傳改良可供利用的基因來源［5］。目前，轉基因育種在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中都已取得成功［6］。多項研究表明，基因序列的微小變化可以對植物基因型產生顯著影響，從而影響植物的表型。新近發展起來的基因組編輯技術有望成為繼突變和轉基因技術之后的育種技術發展的又一個里程碑，主要包括寡核苷酸介導的定點突變、轉錄激活類似效應因子核酸酶技術、鋅指核酸酶、成簇的規律間隔的短回文重復序列系統。以上技術不僅可以特異地修飾某個靶向序列，從而創造新的等位基因，而且與傳統的點突變相比，效率更高、速度更快、無多余的隨機突變。目前，基因組編輯技術在植物的抗病性、除草劑抗性以及營養代謝等相關領域得到成功應用［7］。我們相信在不久的將來，這些基因也將對作物育種產生深遠影響。

4種質資源的利用

4.1作物種質資源利用的傳統途徑

我國對種質資源的傳統利用大致經歷了直接利用、雜交育種和雜種優勢利用3個階段。20世紀50年代初期到60年代中期，我國生產上以直接利用種質資源中的優異地方品種進行就地繁殖和推廣為主。在此基礎上，各地不但相互交換優良品種，而且還從許多其他國家引進了多種農作物優良品種，并通過系統選擇和雜交改良等途徑，實現了兩次品種更新換代，使優良品種得到迅速普及［3］。盡管當時這些改良品種對產量的貢獻率比較低，但是，通過對全國種質資源的篩選，明確了這些作物種質資源所具有的不同特性，為后來作物新品種選育奠定了良好基礎。20世紀50年代后期，雜交育種技術初露端倪，我國就迅速推廣普及雜交育種技術，大規模獨立自主地培育主要農作物新品種。60年代以后，我國自育優良品種已經覆蓋大部分生產面積。這期間，在第一次“綠色革命”浪潮的影響下，我國科學家利用水稻地方品種“矮子占”和小麥創新種質“矮孟?！币约皬膰庖M的矮稈種質資源育成了大量的水稻和小麥矮稈新品種，進一步提高了水稻和小麥的產量水平。雜種優勢是在雜交育種過程中，后代所表現出的超親現象。早在20世紀60年代以前，一些國家就開始在玉米和高粱育種中利用雜種優勢，并使得產量大幅提高。我國的雜種優勢利用工作起步相對較晚，前期工作主要是從國外引進了玉米自交系和高粱雄性不育系，并加以利用，該項工作為我國兩系雜交技術的迅速發展奠定了基礎。20世紀70年代以來，我國“雜交水稻之父”袁隆平院士利用“野敗”不育株，實現了水稻的“三系”配套，成功育成了雜交稻，水稻產量得到大幅提高，并使得我國迅速擺脫了糧食緊缺的困擾，有效提高了我國生產技術水平和糧食自給能力。此后，我國雜種優勢利用技術得到進一步發展，目前，在水稻、玉米、高梁、谷子、小麥、蔬菜、大豆、棉花、油菜等主要農作物新品種培育過程中都不同程度地利用了雜種優勢，不僅使得新品種的產量和品質得到大幅提高和改善，同時為提升我國糧食綜合生產能力和國際農產品市場競爭力提供了堅實的支撐［3］。

4.2與生物技術相結合的種質資源利用途徑

種質資源利用的最終目的是培育出新品種。目前，世界范圍內的育種研究已從傳統的常規育種進入依靠生物技術育種的時代，從單個基因的測序轉為有計劃、大規模地檢測水稻等重要生物體的基因圖譜。目前，全世界已有6000多項農作物方面的生物技術研究成果進入田間試驗，這些也表明，生物技術在作物育種中具有巨大的應用潛力。

4.2.1優異基因挖掘。要實現生物技術在作物育種中的重要作用，首要任務是確定植物群體內基因或基因片段的表達及與表型現象的內在關聯。在這一過程中，目前常用的方法就是基于雙親分離群體(F2、RIL、CSSL、NIL等)的數量性狀位點定位和基于連鎖不平衡的將標記或候選基因的等位變異與目標性狀聯系起來的關聯分析，這2者都屬于正向遺傳學的研究范疇。隨著測序技術的飛速發展，基于高通量測序的QTL定位和關聯分析相關研究也取得了較大進展，并顯示了廣闊的應用前景。而在反向遺傳學中，基因所影響的表型并不清楚，但可通過基于遺傳轉化所進行的基因功能獲得或缺失技術研究基因所引起的表型變異及其功能，并對其加以利用。隨著水稻、玉米等基因組測序的完成，以及結構和功能基因組學的飛速發展，越來越多的作物中的重要性狀相關基因被克隆，如水稻中已克隆的產量與品質相關基因GS3、GS5、GW2、Ghd7，抗病相關基因xa13，抗褐飛虱基因Bph14等［8］。根據已克隆的基因信息，在種質資源中進行目的基因的等位變異分析，找到優異的等位基因，這樣不僅能完成對現有種質資源的精確鑒定，還能對鑒定的含有優異等位基因的材料通過分子標記輔助選擇應用到育種中，從而培育出優良的品種。而對于大麥、小麥等基因組龐大的作物來說，也可以參考水稻等模式植物的研究結果，通過同源克隆、關聯分析等策略對一些重要性狀產生的分子機理進行解析，并對相關基因進行功能鑒定和利用。隨著現代生物技術的高速發展，作物基因發掘出現了一些新的發展趨勢，例如基因組測序技術的更新換代、高通量基因型和表型分析平臺的建立，都將促進基因發掘的規模化和高效化。

4.2.2分子標記輔助選擇。20世紀80年代后期，我國開始利用分子標記輔助選擇進行新品種的培育。分子標記輔助選擇的核心是借助與目標基因緊密連鎖的分子標記，直接選擇目標基因型個體。分子標記輔助選擇不受環境影響，可在早代進行準確、穩定的選擇，而且可以克服再度利用隱性基因時識別難的問題，并能同時聚合多個目標基因，因此，可大大提高育種效率和水平。隨著現代生物技術的高速發展，各主要作物越來越多的重要性狀相關基因被定位或克隆，這將極大地促進作物分子標記輔助選擇育種技術的應用。在種質資源的應用工作中，我們應以種質資源的鑒定評價、種質創新和優異基因挖掘等工作為基礎，通過分子標記輔助選擇，有目的的將野生近緣種屬、地方農家品種和國外引進優異種質中的有益基因導入栽培種中，從而對栽培種進行性狀改良，創造出一批更適合育種需要的中間材料。

4.2.3分子設計育種。種質創新和基因挖掘是對種質資源研究工作的提升，對種質資源進行充分利用則是作物種質資源研究工作的最終目的?？茖W技術的不斷發展將使得作物基因發掘的速度和數量大幅提高，這也將促進后基因組時代的到來，加深我們對基因互作的了解，從而揭開作物重要性狀的基因網絡調控途徑。因此，在創制一批滿足育種需要的中間材料的同時，還應著眼于未來，結合分子標記輔助選擇，將挖掘到的優異基因導入到該作物的當前應用廣泛、綜合性狀優良的某一品種中，構建包括高產、優質和高抗等基因的一系列的近等基因系;以上述近等基因系為材料，通過基因的定向組裝達到性狀的協調改良，突破傳統育種的瓶頸，實現作物品種的精準分子設計育種。同時，我們也應該把握機遇，充分利用植物基因組學和生物信息學等前沿學科的重大成就，及時開展分子設計育種的基礎理論研究，建立具有自主知識產權的分子設計育種技術體系和技術平臺［9］。

5展望

當代生物技術的高速發展，如高通量表型和基因型鑒定技術，使得種質資源創新和利用的各個環節都融入了現代高新科技的元素。有理由相信，這些工作的順利完成將為選育突破性農作物新品種、發展現代種業、保障糧食安全提供物質和技術支撐。

參考文獻:

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第3篇：正向遺傳學克隆基因的方法范文

關鍵詞秀麗隱桿線蟲 模型 藥物篩選 藥靶篩選

Applications of Caenorhabditis elegans in drug screening

ZHOU Yu-meng，CHEN Dai-jie*

（Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry of China State Institute of Pharmaceutical Industry，

State Key Lab for New Drug and Pharmaceutical Process，Shanghai，200040）

ABSTRACTCaenorhabditis elegans (C. elegans) has attracted an increasing attention of pharmaceutical scientists working on drug screening. A relatively complete technology platform for drug screening has been formed by this model. The characteristics of C. elegans as new drug screening model，disease models established by C. elegans currently and their application in discovery of new drug are described in this review.

KEY WORDSCaenorhabditis elegans; model; drug screening; target of drug screening

生物學界對秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C. elegans）的研究始于20世紀60年代。英國科學家Brenner [1]選擇了線蟲作為確定完整神經系統的較為簡單的生物模型。隨后，Sulston經過20年的努力，到20世紀90年代中期構建了完整的線蟲細胞譜系圖，使線蟲成為唯一一個身體中所有細胞能被逐個盤點并歸類的生物。Horvitz利用遺傳突變和基因克隆等手段，揭示了線蟲細胞程序性死亡的遺傳調控機制，并證明相應的調節基因在高等動物和人體中也存在。這三位科學家的研究對生命科學領域做出了極為重要的貢獻，于2002年分享了諾貝爾生理或醫學獎[2]，使秀麗隱桿線蟲成為當代生命科學和醫學研究中最重要的模式生物之一。

近年來，秀麗隱桿線蟲在藥物或靶蛋白篩選方面越來越受到藥物學家的青睞，已形成了較為完善的藥物篩選技術平臺。本文從藥物研發的角度討論線蟲作為模式生物的特點，以及目前利用秀麗隱桿線蟲建立的疾病模型在新藥發現中的應用。

1秀麗隱桿線蟲整體生物模型的特點

秀麗隱桿線蟲屬于線形動物門線蟲綱動物，結構如圖1[3]所示。利用秀麗隱桿線蟲整體生物能夠建立和模擬與人類疾病相關的模型、篩選不同的新型活性物質并發現新穎生物功能的靶點或靶標，實現這些目標的基礎主要在于以下兩個方面。

1.1線蟲整體生物模型的優點[4]

1）蟲體?。ǔ上x1 mm），容易操作（線蟲可以飼養在含有大腸埃希菌的瓊脂平板或是液體培養基中）并且便于長期保藏（蟲體可以凍存在甘油中）。2）發育的各個階段蟲體呈透明狀，可以通過微分干涉對比（differential interference contrast，DIC）顯微鏡和各種熒光顯微鏡對所有細胞進行觀察。3）世代和生命周期較短。在實驗室20 ℃的環境下，從卵發育到成蟲只要4 d，平均壽命為3周。4）繁殖快并且多產。一只雌雄同體線蟲可以產下300多個后代，經雄蟲后可以產下1 000多個后代。5）一個雌雄同體的成蟲完整固定不變的體細胞有959個，雄蟲有1 031個。6）發育專門的生理器官，神經環和神經節、腸道、肌肉、皮下組織、排泄系統、先天免疫系統、性腺和子宮。7）完整的神經網絡圖，302和391個神經元組成雌雄同體成蟲和雄蟲的神經系統。8）具有復雜的行為學特征，包括機械感知和化學感知，避免有害刺激物和溫度趨向性。9）擁有完善的實驗技術，包括轉基因動物技術、單細胞激光光解技術、通過化學誘變和RNA干擾進行正向和反向的遺傳基因篩選、通過個體大小和熒光采用流式細胞儀對線蟲進行數量控制、表型特征對應的單細胞多態性圖譜（SNP mapping）和小分子化合物庫的篩選。10）一個完整的基因組序列，含有約19 700編碼序列和約1 300非編碼RNAs。11）完整的基因組文庫和cDNA克隆。12）一個線蟲突變保藏中心，擁有大量突變體線蟲。13）豐富的免費網絡資源（如WormBook）和數據庫（如WormBase）。

1.2線蟲與人類基因之間的保守性

以秀麗隱桿線蟲為模型來模擬人類疾病是最簡單直接的，但是兩者之間的藥物靶點要具有保守性。慶幸的是，這種保守性的確存在。依靠生物信息學方法，發現已知的秀麗隱桿線蟲藥靶基因與人類基因的同源性達到60%～80%[5]。在許多重要的信號傳導途徑中，線蟲都存在高度保守性，如與細胞增殖分化相關的途徑包括RAS信號途徑、Notch信號途徑和Wnt信號途徑[6～8]；與免疫相關的途徑包括TGF-β信號途徑、胰島素信號途徑、p38 MAPK信號途徑和Toll信號途徑[9～12]等。在孟德爾人類遺傳資料庫（Online Mendelian Inheritance in Man）的2 466個人類疾病基因中，有533個與秀麗隱桿線蟲同源[13]。

鑒于線蟲具有豐富的生物學、遺傳學信息的研究以及作為模式生物的優越性，使其在人類疾病研究和新藥開發中發揮著重要的作用。

2基于秀麗隱桿線蟲的疾病模型及在新藥發現中的應用

目前，已建立了大量的秀麗隱桿線蟲模型和有效的研究方法來模擬人類疾病，并實施大規模高通量化合物的篩選。

2.1代謝綜合征疾病的線蟲模型

2.1.1糖尿病模型

胰島素超家族基因普遍存在于脊椎和非脊椎動物中。在秀麗隱桿線蟲中存在胰島素樣信號途徑（insulin-like signaling pathway），負責控制代謝、生長和壽命，其中daf-2基因編碼屬與哺乳動物同源的胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGFs）受體家族[14]。秀麗隱桿線蟲daf-2基因突變株發育受限，只能停留在dauer幼蟲期，但當胰島素樣信號途徑被刺激后，可以二次生長，發育成成蟲，故能使daf-2基因突變株轉變成成蟲的化合物可能對人類胰島素信號傳遞存在調節作用。因此，DevGen公司利用daf-2基因突變株建立了抗2型糖尿病的藥物篩選模型，并于2001年申請了專利[15]。隨后，該公司又構建了能產生定量熒光信號的daf-2基因工程蟲體，建立了高通量篩選方法。

2.1.2脂肪代謝模型

研究人員利用線蟲尋找影響脂肪代謝的相關基因，為治療肥胖和相關疾病提供研究靶點。Lemieux等[16]對3 200個化合物進行篩選，用尼羅紅（Nile Red）染色來監測處理2 d后的線蟲脂肪水平，發現有2種化合物可以誘導脂肪增加、8種化合物可以降低脂肪含量。實驗人員針對F17化合物進行研究，發現該化合物是AMP-活化蛋白激酶（AMP-activated kinase，AMPK）拮抗劑，能有效降低線蟲脂肪儲存（見圖2[17]）。

用野生型線蟲對3 200個化合物進行篩選，2 d后尼羅紅染色并檢測脂肪水平。大部分化合物是無效的，線蟲脂肪水平與對照相似（中間的線蟲）。2個化合物可以增加線蟲脂肪含量（頂部的線蟲），8個化合物可以降低脂肪含量（底部的線蟲）。其中一個化合物F17影響脂肪含量降低是依賴于AMPK（aa-1）和轉錄因子K08F8.2。

Chronogen公司采用另外一種線蟲脂肪代謝模型[18]，利用clk-1缺陷型線蟲排便循環的長短直接受膽固醇量調節的特點，篩選了20 000個小分子化合物，得到190個陽性化合物（hits），再用人肝癌細胞HepG2驗證，其中15個化合物能減少細胞ApoB100的分泌，而化合物CHGN005效果最好。在隨后的小鼠活體高血脂模型中，CHGN005可以明顯降低膽固醇和甘油三酯的含量，進一步驗證了此化合物的活性。

2.1.3衰老模型

利用秀麗隱桿線蟲研究衰老現象和老化相關的疾病已經有近30年的歷史。秀麗隱桿線蟲生命周期較短，使其成為衰老研究和抗衰老藥物篩選的理想模型。目前，主要采用野生型N2和突變體線蟲（如daf-16、daf-9等）作為實驗動物。

Evason 等[19]以具有不同結構、不同藥效的19個經FDA 批準的藥物組成小樣本庫篩選發現，抗癲癇藥物乙琥胺（ethosuximide）能使秀麗隱桿線蟲的壽命延長17%，并存在明顯的量效關系。構效關系研究表明，與乙琥胺結構類似并具有抗癲癇作用的化合物三甲雙酮（trimethadione）和3，3-二乙基-2-吡咯烷酮（3，3-diethyl-2-pyrrolidinone）也能明顯延長秀麗隱桿線蟲的壽命，而與乙琥胺結構類似、但無抗癲癇作用的化合物丁二酰亞胺（succinimide）卻沒有延長秀麗隱桿線蟲壽命的作用。作者推測，可能是上述化合物的抗癲癇機制與延長秀麗隱桿線蟲壽命的機制相同、通過影響線蟲的神經活動而導致生命延長。

Petrascheck 等[20]用秀麗隱桿線蟲篩選抗衰老藥物，篩選了 8.8 萬個化合物，發現 115 個化合物能延長秀麗隱桿線蟲的壽命，有4個化合物是5-羥色胺受體抑制劑，它們能使秀麗隱桿線蟲的壽命延長22%～30%，其中包括抗抑郁藥米安色林（mianserin），但米安色林不能延長對5- 羥色胺的合成、攝取發生變異的線蟲壽命。研究人員認為，米安色林能阻斷線蟲與覓食有關的神經遞質的信號傳遞，產生饑餓感，導致線蟲壽命延長。

Gerisch等[21]發現一種膽酸化合物dafachronic acid與秀麗隱桿線蟲的衰老調控有關。白藜蘆醇（resveratrol）能延長酵母、果蠅、小鼠的壽命，也能延長秀麗隱桿線蟲的壽命[22]。具有抗氧自由基損傷的化合物如維生素E、輔酶Q等以及藍莓、銀杏葉提取物也能延長秀麗隱桿線蟲的壽命[23]。

延長人類壽命一直廣受關注，但是有關人類生命周期的探索才剛剛起步，基因調控、系統調控、環境和精神因素等都在不同水平上影響人類壽命。能延長線蟲壽命的化合物（見圖3）在結構上差異較大，說明小分子對衰老的干預具有多靶點、多機制的特征。值得注意的是，干預神經活動的小分子能延長秀麗隱桿線蟲壽命，說明神經活動可能與衰老現象有關，但是這些分子能否成為抗衰老藥物還需要一個漫長的評價過程。而白藜蘆醇是通過Sir2蛋白進行調控，與神經干預機制無關，這種分子似乎更具有抗衰老研究的價值。

2.2神經系統退化性疾病的線蟲模型

2.2.1阿爾茨海默病模型

研究者在線蟲中發現早老素（presenilin）sel-12基因，其編碼的蛋白具有多跨膜結構域，并且與阿爾茨海默病（AD）相關蛋白S812相似。目前已構建了轉基因線蟲模型，將人源β-淀粉樣蛋白在線蟲中異源表達，誘導淀粉樣蛋白沉淀物形成，引起線蟲麻痹，從而導致線蟲“排卵”困難[24]。Pharmacia & Upjohn公司開發了一個“幾丁質酶檢測”方法，可以間接地監測排卵數量，其原理是：秀麗隱桿線蟲的胚胎會分泌幾丁質酶，以便從卵中孵化出來。幾丁質酶濃度越高，線蟲排卵數量越多。輝瑞公司正利用轉基因線蟲AD模型和幾丁質酶檢測技術對10 000多個化合物進行高通量篩選，期望獲得有效的抑制劑[25]。

2.2.2帕金森病模型

利用線蟲建立帕金森病模型主要有兩種：轉基因線蟲模型和藥物誘導模型。轉基因模型是通過過量表達人源α-突觸白、導致線蟲的神經元和樹突損傷模擬帕金森病的[26]，而藥物誘導模型是利用神經毒素1-甲基-4-苯基吡啶 （1-methyl-4-phenylpyridine，MPP）選擇性誘導多巴胺神經元凋亡，使線蟲運動能力下降、死亡數增加。Braungar等[27] 對一些帕金森病治療藥物進行評估，其中多巴胺受體拮抗劑麥角乙脲（lisuride）和阿樸嗎啡（apomorphine）以及蛋白激酶C抑制劑卡馬拉素在低劑量和高劑量時都對線蟲有治療效果。

2.2.3亨廷頓病模型

已知亨廷頓病的病因是由于亨廷頓（Huntingtin）蛋白末端的多聚谷氨酰胺（polyQ）延伸造成的。線蟲模型就是采用轉基因技術，將人源亨廷頓蛋白的N末端基因序列注射到線蟲體內，轉基因動物神經細胞凋亡，出現神經細胞蛋白沉積并隨年齡逐步增加的癥狀[28]。利用此模型，Voisine等[29]評估了9個可能有治療效果的藥物，其中4個能緩解polyQ的毒性，以FDA批準的亨廷頓病治療藥物光輝霉素（mithramycin）和氯化鋰表現尤為突出。

2.3抑郁的線蟲模型

抑郁線蟲模型研究就是利用化學遺傳學方法將抗抑郁藥物氟西汀作用于線蟲，觀察藥物對線蟲表型的影響。氟西汀會阻斷5-羥色胺再攝取轉運載體（serotonin reuptake transporter，SERT）MOD-5，增加突觸間5-羥色胺的濃度。由于5-羥色胺信號增強，從而刺激控制線蟲排卵的肌肉神經，增加線蟲排卵量[30]。在哺乳動物中，SERT是MOD-5的同系物，也是氟西汀作用的主要靶標，說明利用線蟲模型可以發現治療抑郁的有效藥物。

2.4肌肉萎縮癥模型

模擬人類遺傳疾病的線蟲模型包括多囊性腎病、肌肉萎縮癥等。研究人員發現線蟲的dys-1基因與導致人肌肉萎縮癥（DMD）的肌萎縮蛋白基因同源，采用基因敲除技術構建突變體線蟲dys-1，此突變體表現出類似人類DMD的肌肉組織逐漸退化、運動能力喪失的病癥。當實施強的松治療后，這種癥狀可以得到緩解[31]。

2.5高通量篩選和靶點研究的方法

線蟲既提供了完整動物實驗系統，又避免了小鼠模型的高價費時，是最適合大規模藥物篩選的多細胞動物。目前，秀麗隱桿線蟲越來越受到生物化學家的青睞，利用線蟲高通量篩選活性化合物、研究藥物作用靶點正在成為流行趨勢[32～36]。Roy等[37]建立了一個24孔板高通量篩選系統，使用秀麗隱桿線蟲模型發現具有生物活性的小分子化合物，并用化學遺傳學方法鑒定化合物作用靶點。整套系統由兩個主要的設備組成：COPAS（Complex Object Parametric Analyzer and Sorter）Biosort和自動圖像獲取處理系統（見圖4[37]）。每周可以篩選化合物達到2 400個。通過觀察表型的變化（見圖5[37]），推測篩選化合物的生物學活性。為了進一步確證其作用靶蛋白，利用甲磺酸乙酯使線蟲突變，篩選對此化合物具有抗性的突變體線蟲（見圖6[37]），確定突變蛋白，最終確證作用靶標。對于靶點的鑒定大約需要幾個月的時間。

采用這套系統，Roy等研究人員對14 100個小分子化合物進行篩選，有308個化合物可誘導野生型線蟲產生表型異常，最終發現一個小分子鈣離子通道拮抗劑nemadipine-A。其與二氫吡啶類抗高血壓藥（DHPs）類似，能夠引起線蟲形態缺陷和排卵、產卵困難，通過遺傳學方法確定L型鈣離子通道的α1亞基是nemadipine-A的作用靶點，與已知的DHPs作用機制完全一致[38]。

線蟲是一種簡單的模式宿主，可以被多種人類病原菌感染和殺死，其中包括革蘭陽性菌糞腸球菌、金黃色葡萄球菌，革蘭陰性菌銅綠假單胞菌、沙門菌以及一些真菌白色假絲酵母等。Moy等首次利用秀麗隱桿線蟲這一特性，建立了糞腸球菌感染模型，對6 000個化合物和1 136個天然提取物進行篩選，其中16個化合物和9個天然提取物具有提高線蟲存活率的活性[39]。隨后，他們對方法進行改進，建立了384孔板自動化分析采集的高通量篩選系統[35]。這套系統采用SYTOX 黃染料將存活線蟲和死亡線蟲進行區分并用熒光檢測，通過對比熒光強弱判斷線蟲存活率，較之前的人工操作系統工作效率提高5倍以上。將篩選規模擴大到37 200個化合物和天然提取物，發現了28個未經報道的具有提高線蟲存活率的活性化合物，其中有6個結構新穎的化合物體外不影響病原菌生長，說明它們與臨床上所用的抗生素具有明顯不同的作用機制。目前還建立了白色假絲酵母-線蟲感染高通量篩選模型[32，34]，對3 228個化合物篩選，發現了19個化合物具有抗真菌感染活性，其中7個是臨床上用于抗真菌感染的藥物、12個臨床上沒有用作抗感染藥物，還有另外3個藥物是免疫抑制劑。這些事實說明線蟲感染模型不但可以發現抗感染化合物，還可以尋找到一些作用機制新穎、具有其它生物學活性、輔助抗感染作用的化合物。

3結語

在許多生物途徑中，秀麗隱桿線蟲與人類之間都具有保守性。因此，從某種程度上講，秀麗隱桿線蟲的研究數據可以預測藥物-靶標相互作用和確證靶點。通過對秀麗隱桿線蟲的研究可以更好地了解許多人類疾病的病理機制。盡管存在很多優點，但是不可否認，秀麗隱桿線蟲體系在新藥發現中仍存在缺陷。例如，線蟲沒有心臟、獲得性免疫系統、呼吸系統等，一些分子途徑在線蟲體系中不存在，這些途徑就不能通過線蟲進行研究。此外，秀麗隱桿線蟲與人類種間距離太遠，不能完全模擬或無法模擬人類病理。因此，周密的實驗方案設計、模型潛在缺陷的克服、線蟲疾病模型和人類病理某一方面具有一致性的確證成為模型成功和新藥發現的關鍵。當這些條件具備時，秀麗隱桿線蟲在醫藥研究領域的價值就會更好地表現出來。秀麗隱桿線蟲模型為體外篩選和體內篩選架起了一座橋梁，為新藥的發現增加了一個新途徑。

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第4篇：正向遺傳學克隆基因的方法范文

[關鍵詞]瘢痕疙瘩；Fas基因；多態性；遺傳易感性

[中圖分類號]R619+.9[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）03-03

Fas gene -670 polymorphism and susceptibility to keloid in a Chinese population

ZHUO Yang,ZENG Xing-ye, ZHOU Xue-xue,HUANG Da-dao,CAO Xiao-en,HUANG Zheng-lian

（Department of Surgery,the 118th Hospital of PLA,Wenzhou 325000,Zhejiang, China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between Fas-670 polymorphism and susceptibility to keloid in a southern Chinese population.MethodsThe Fas-670 genotypes were determined by polymerase chain reaction-reverse dot blot(PCR-RDB) and DNA direct sequencing in 75 patients with keloid and 120 unrelated healthy controls.ResultsThe frequency of the Fas-670 A allele among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=4. 408,P=0.036). The A/G and G/G genotype distribution among keloid patients was not significantly different from that among healthy controls(χ2=1.051 and 1.134; P=0.305 and 0.287, respectively). However, the A/A genotype frequency among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=5.207,P=0.022). The Fas-670 A/A genotype significantly increased the risk for developing keloid,compared to the combination of A/G and G/G genotypes,with the odds ratio(OR) of 2.122, (95%CI: 1.105～4.077).ConclusionDetermination of the Fas-670 genotype may be used as a stratification marker to predicate high-risk individuals for keloid.

Key words: keloid; Fas gene; polymorphism; genetic susceptibility

近幾年的研究結果提示，瘢痕疙瘩成纖維細胞的過量增生和凋亡相對減少在瘢痕疙瘩的發生、發展中起著重要作用[1]。而Fas蛋白是細胞表面一種與凋亡相關的抗原，Fas介導的凋亡被認為是介導死亡信號傳遞的最主要通道。為此,我們從分子遺傳學角度，探討Fas基因-670位點多態性與浙江地區漢族人群瘢痕疙瘩發病風險的關系, 以便深入地、多層次地解析瘢痕疙瘩的分子生物學機制。

1對象和方法

1.1 研究對象：瘢痕疙瘩患者和正常對照人群均為浙江地區漢族居民。瘢痕疙瘩患者均經本院臨床及病理診斷證實，共75例，其中男41例、女34例,年齡9～53歲，病變位于前胸、三角肌區及耳垂，病史6個月～15年。正常對照為有外傷史而無瘢痕疙瘩產生，且無瘢痕疙瘩家族史的健康居民，共120例，其中男69例、女51例,年齡13～60歲,平均年齡29.6歲。用于基因分析的DNA全部來源于研究對象的外周靜脈血，血樣本用枸櫞酸鈉抗凝，置于-20℃保存備用。

1.2聚合酶鏈反應-反向點雜交（PCR-RDB）

1.2.1基因組DNA提取：采用北京賽百勝生物技術有限公司的基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 ASO（等位基因特異性寡核苷酸）探針設計：應用Primer Premier5.0設計探針，氨基標記，探針序列分別為：NH2-5′-CATTCCAGGAACGTCTGTGA-3′；NH2-5′- CATTCC AGA AACGTCTGT GA -3′，由上海生工生物公司合成。

1.2.3 PCR反應：用于擴增Fas基因-670位點的引物5′端標記了非同位素檢測介質Biotin,引物序列為：Bio-5′- TGTTCACCAGAGCACGAAAG -3′；Bio-5′- GCTGGC ATCTCACTTCAGGT -3′，由上海生工生物公司合成。反應在PE-480型擴增儀(美國PE公司)上進行。在50μl反應總體積中,含引物8.0pmol/L，DNA模板1μl，加入2UTaq酶(鼎國生物公司)。熱循環參數：95℃熱啟動2min后，95℃45sec，55℃1min，72℃/2min；共35個循環 72℃延伸 10min。取3μl擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色,紫外透射儀下觀察結果。

1.2.4 雜交：固化上寡核苷酸探針的膜條連同40μlPCR產物加入含5ml 2×SSC～0.1%SDS的試管中，100℃水浴變性7min，置雜交儀中42℃雜交3～6h；然后放入42℃預熱的0.5×SSC～0.1%SDS中洗膜10min；將膜條轉入含2.5U辣根過氧化物酶連鏈酶抗生素蛋白的10ml 2×SSC～0.1%SDS試管中，室溫反應15min；再用2×SSC～0.1%SDS洗膜5min×2次；最后，將膜條轉入20ml顯色液[19ml 0.1mol/L檸檬酸鈉(pH5.0)中加30%過氧化氫3μl和0.1mg/ml TMB]中避光顯色5～15min,期間觀察、記錄結果。

1.3 為檢驗反向點雜交結果的正確性，隨機抽取18例PCR擴增產物送上海生工生物公司測序。

1.4 統計學處理：應用SPSS10.0統計軟件包處理數據，采用χ2檢驗分析各組等位基因和基因型頻率分布的差異，并計算表示相對風險度的比值比(odds ratio,OR)及其95%可信區間(confidenceinterval,CI)。

2結果

根據我們設計的方案，雜交結束后膜條上格顯示藍紫色斑點為A/A基因型，中格顯示藍紫色斑點為G/G基因型，而上、中全部顯示為A/G基因型，下格為空白對照，無斑點顯示（圖1）。瘢痕疙瘩組和正常對照組Fas基因多態性比較如表1、2所示。

實驗中，在瘢痕疙瘩和正常對照組間的年齡構成比例相似，對照組及瘢痕疙瘩患者組的Fas-670位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡的情況下，結果顯示：①瘢痕疙瘩組的A等位基因頻率(54.7%)明顯高于正常對照組(43.8%)(χ2=4.408,P=0.036,P＜0.05)；而瘢痕疙瘩患者的A/G、 G/G基因型頻率分別為40.0%和25.3%， 與正常對照組相比差異無顯著性 (χ2值分別為1.051和1.134； P值分別為0.305和0.287)；②瘢痕疙瘩組的A/A 基因型頻率為34.7%，明顯高于正常對照組(χ2=5.207,P=0.022,P＜0.05)。與A/G、G/G基因型相比，A/A 基因型者患瘢痕疙瘩的相對風險性(OR)明顯增高(OR=2.122,95%CI: 1.105～4.077)。我們隨機抽取的18例PCR擴增產物測序結果與反向點雜交結果完全吻合（圖2），證明了聚合酶鏈反應-反向點雜交結果的正確性。

3討論

近年來，遺傳因素在許多疾病的發生中所起的重要作用備受重視，且已發現了多種易感基因的存在。Fas基因即是目前較為關注的與瘢痕疙瘩疾病相關的基因之一。人Fas基因組DNA位于染色體10q24上，是全長36Kb的單拷貝基因，由8個內含子及9個外顯子組成，編碼335個氨基酸，其全稱是factor associated suicide，又稱CD95/APO-1，屬于NGF/TNF受體家族，其相應的配體及單克隆抗體與之結合后可誘導細胞凋亡。Fas蛋白包括膜外區、跨膜區和膜內區，Fas蛋白的重要功能結構“死亡域”編碼區位于膜內區[2]。已證實FasR-FasL系統在調控細胞增殖和凋亡中起著重要的作用[3-4],Fas介導的凋亡被認為是介導死亡信號傳遞的最主要通道。

Fas 基因啟動子區域存在兩個多態性位點[5],其啟動子-670 核苷酸APG多態性位點位于核轉錄元件GAS 中,能影響干擾素的信號傳導。干擾素與其受體結合后,激發了酪氨酸激酶Jak(janus kinases),使轉錄信號傳導和激活因子-1(signal transducers and activitors of transcription1,STAT1) 酪氨酸磷酸化,磷酸化的STAT1 形成同源二聚體與GAS元件結合,誘導含有GAS元件的基因轉錄[6]。當然其他細胞因子與其受體結合后,也可通過STAT家族成員誘導含有GAS元件的基因轉錄[7]。若Fas-670 位點堿基為G,則含有GAS元件的一致序列TTCNNNGAA(N3 位點) ,該序列能被STAT家族的多數成員識別[8],細胞因子-受體作用激活STATs,從而誘導Fas基因轉錄。而堿基A代替G后,則DNA序列變為TTCNNNAAA,可能影響Fas轉錄，影響Fas蛋白表達。已有報道其他基因GAS元件能夠影響轉錄水平[9]。

國外對Fas-670位點多態性與自身免疫性疾病相關性研究,提示AA 基因型與白種人類風濕性關節炎的臨床亞型相關[10]，系統性紅斑狼瘡、多發性硬化患者A等位基因頻率顯著增高[9-10]。然而,國內外尚未見Fas 基因多態性與瘢痕疙瘩的相關性研究。本研究初步結果提示，Fas基因-670位點A等位基因及AA基因型是中國浙江地區人群對瘢痕疙瘩的易感因素。我們的初步研究結果對瘢痕疙瘩的預測診斷及篩選具有較大潛在的臨床意義，然而更大樣本、更多地域、多民族的印證研究尚有待完善。

本實驗采用的聚合酶鏈反應-反向點雜交方法是由Saiki RK[11]于1989年首次提出，雖然在原理上與正向斑點雜交相似，但卻巧妙地反其道而用之,即反方向的將各種探針固定在基質上,用以檢測受檢的各種標記樣品中與探針互補的核酸物質的變化。近年來應用此法進行β-地中海貧血、囊腫性纖維化等疾病的基因診斷，取得較好效果。該方法分辨率高，技術簡便、快速、可靠，其檢測結果與DNA測序符合率高，值得推廣應用。

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第5篇：正向遺傳學克隆基因的方法范文

[關鍵詞]生命倫理學；中國難題；現代醫療技術

[中圖分類號]B82～05[文獻標識碼]A[文章編號]1671-511X（2012）02-0005-06

一、問題的提出

生命倫理學的誕生和發展，與現代醫療技術的高速發展及其不斷展現的復雜而多變的“醫療實踐”領域及其急速變革有關。進入20世紀以來，現代醫療技術以前所未有的方式凸現出日益尖銳的生命倫理難題，它們在不斷地“書寫”人類依靠技術治療疾病、增進健康、強化生命的各種“傳奇”的同時，也對人類的倫理規范和法律制度帶來了前所未有的挑戰。一種我們可以稱之為“醫療-技術”現象（或者“技術-醫療”現象）的醫學進步和生命倫理實踐，正在不斷地將遺傳學、神經科學（腦科學）、干細胞技術、基因技術和計算機輔助技術（例如影像技術）等現代科學技術，帶人醫療實踐；而與此同時，幾乎每一項由現代科技進步帶來的醫學進步，都對舊有的生命倫理學理論與實踐以及與之相關的醫事法學帶來咄咄逼人的挑戰。生命倫理學面臨如許眾多的質詢，例如：如果我們相信技術進步能夠帶來醫學進步（這一點我們堅持一種樸素的信念），那么它如何才是一種道德的進步以及法律的進步？該問題使得現代醫療技術所開啟的醫療技術行為，儼然成了從生命倫理學視野上影響現代技術挑戰倫理及法律問題的“爆發地”！而每一次技術對倫理或法律的挑戰（如器官移植技術、克隆技術、基因診斷技術、以神經科學為基礎的腦服務技術等），都迫使科學家、醫生、法學家、社會學者、政府、媒體和公眾必須動員起來尋找應對的良方。各種各樣的倫理難題、法律難題和倫理一法律難題仍然如揮之不去的魅影，與現代醫療技術及其醫療實踐如影隨形。

于總體上看，生命倫理學的中國難題，以現代醫療技術為例，主要集結于現代醫療技術中的倫理難題以及法律難題。從邏輯上看，它大致包括倫理難題、法律難題以及倫理一法律難題三個方面。

其一，倫理難題。即使法律支持該技術，我們在倫理上仍然面臨無法解決的難題，存在著諸“理”之沖突而每一種“理”都有理的情況。倫理難題的典型形式有三種：（1）倫理與倫理之間的沖突。即有兩種倫理，一種是從個體自由出發的倫理（它主要關涉權利問題），一種是從總體責任出發的倫理（它以義務為首要原則），這兩種倫理在特定的醫療技術境遇中，存在相互沖突的情況。（2）一種倫理體系的內部存在著的道德與道德之間的沖突。即醫療行為主體之間（醫生與病人）可能存在道德理由或道德主張上的分殊和相互沖突的情況，從而在醫生的權利與病人的權利之間產生尖銳的道德沖突。（3）在一種集團倫理或組織倫理的特定境遇中存在著倫理與道德之間的沖突。比如醫院組織對個體有普遍性的倫理約束，而個體的道德原則又可能存在著與組織的倫理規約相沖突的情況，于是在特定的醫療技術行為中，出現了“道德的個人和不道德的組織”這樣的倫理一道德悖論。

其二，法律難題。廣義的法律難題必定是從倫理難題而來，然而在生命倫理學中存在著一類相對狹義的法律難題，它將倫理的討論存而不論，在尋求一種“倫理中立”的法律解釋和立法實踐的過程中遇到了支持與反對都有法律依據的情況，包括兩個方面：一是法律解釋的難題，如兩種解釋都可能是正確的，但它們彼此相互沖突；一是立法依據的難題，在是否立法（比如針對安樂死或醫自殺的藥物和技術的應用問題）以及如何立法等問題上皆存在著相互抵牾的主張，且似乎各自都能自圓其說。

其三，倫理一法律難題。倫理一法律難題或者主要地由倫理難題而來，或者主要地由法律難題而來，它是內含著倫理和法律因素且在二者之相互關聯問題上呈現的難題。代表性的倫理一法律難題有兩大類：（1）現有倫理上的析理無法為法律上的適用提供依據，而現有法律規范或解釋又無法體現倫理的價值、原則和道德理由，于是出現了倫理失靈和法律失靈的情況；（2）又或者，倫理上的支持和反對都符合法律解釋原則，而法律上的支持和反對都有強有力的倫理上的支持。倫理分析、道德論爭和推理是法律問題之求解的基礎，許多法律難題的產生乃由于倫理難題尚得不到治理或澄清；同樣，法律的解決方案往往又作為權宜之計不能真正地為倫理難題找到出路。

二、生命倫理學的中國語境與問題癥候

近十年來，伴隨著克隆的多利羊（1997年）的誕生以及人類胚胎干細胞被成功地分離（1998年），以及人類基因組圖譜的繪制成功等一個又一個的技術進步及其在醫療實踐中的運用，生命倫理學愈來愈聚焦于現代醫療技術及其醫療技術實踐所展現的倫理難題、法律難題以及倫理一法律難題。生命倫理學的中國語境亦受到醫療技術最新進展的影響：（1）在漢語語境下，現代醫療技術對倫理與法律的挑戰，成為亟需從文化、社會、宗教、倫理、法律等人文價值世界領域進行治理的難題；（2）而一些似乎已經被解決的問題（如腦生或腦死的問題）又重新成為新的倫理一法律難題；（3）由于現代醫療技術及其臨床研究和應用，前所未有地關涉到相關主體的權利、責任、義務和相關制度的公正問題，以及前所未有地標示出技術本身存在的大量風險和不確定性，因此它必須獲得倫理與法律的支持，且極大地依賴于倫理難題或法律問題的治理或解決。在復雜的國際背景下，各國政府被迫對現代醫療技術的倫理與法律挑戰作出回應，即從倫理治理與法律對策兩個方面籌劃或者設計一種有利環境，既促進現代醫療技術（尤其是高新生物醫學技術）的發展，又盡量避免社會被高新技術所侵害。這使得生命倫理學的研究于總體上愈來愈面向“應用”，且愈來愈介入具體的社會決策或社會行動。例如：針對干細胞轉化醫學等高新生命技術的醫療實踐及其產生的生命倫理難題，英國于2005年通過英國經濟和社會研究理事會啟動了“社會科學干細胞行動”，鼓勵人文學者、倫理學家、法學家等介入這一領域；歐盟的BIO-NET項目，旨在希望中歐合作研究生物醫學技術中的倫理治理問題。

中國衛生部于2009年3月2日出臺了《醫療技術臨床應用管理辦法》。這個文件可以視做我國從政策層面應對現代醫療技術帶來的各種問題（尤其是倫理問題與法律問題）的官方文件，是一個里程碑式的文件。它對我國醫療領域的技術創新和醫療抉擇有指導性的作用。然而，這個“管理辦法”并不是我們解決現代醫療技術的倫理與法律問題的“靈丹妙藥”，由于遇到的問題有些是非常棘手的倫理難題或法律難題，它甚至無法給出具體的實施細則。因此，中國生命倫理學亟需完成一種“語境梳理”，即從理論與實踐兩個方面，從更廣泛深入的實踐探索中，以及更多維交叉的跨學科視野的關注或研究中，尤其重要的是在與科學家或醫療領域研究者和實踐者的對話研究中，進一步探討我國現代醫療技術中的倫理治理和法律對策。

另一方面，我們應該看到，現代醫療技術在中國醫療實踐領域的研發、傳播和使用，除了造成普遍的倫理與法律問題之外，也正在形成“醫療技術的中國問題”。這些問題主要表現在：第一，現代醫療技術的發明、應用及其對社會整體的影響，對中國人的傳統哲學觀、價值觀、生存方式和生活方式的沖擊，讓中國人產生越來越大的“隔離”感；第二，各種高新生命技術的研發和使用，也正在影響著人們的具體生活，比如，醫療上的器官移植技術、基因診斷技術、試管嬰兒技術，等等，這些技術的使用也正在考驗中國人的倫理意愿，改變中國人的道德生活方式，同時也對現有的法律解釋提出了挑戰；第三，由于中國傳統倫理道德、社會文化形態和生活思維方式，與主要是在西方文化傳統上建構起來的現代性醫療技術體系存在一定的差異，一些在西方語境中可以發揮作用的倫理或法律規范有可能在中國社會失效，從而形成了具有中國特色的“中國生命倫理學難題”。

生命倫理學的中國語境，一般而言，源于現代社會對現代醫療技術中產生的與權利、義務、責任和公正有關的倫理及法律問題的廣泛而深刻的關注與激烈的論辯；特別地說，源自醫療技術在挑戰倫理及法律的過程中，對中國醫療民生和中國醫療技術進步帶來的重大影響。

從學說史的角度或者學術語境看，中國大陸學者對生命倫理的中國難題的研究和關注，是與生命倫理學這門新興交叉學科在中國大陸的產生、發展和不斷成長的歷程密不可分的。一般認為，大陸生命倫理學開始于1979年，以美國肯尼迪研究所的學者訪問中國社會科學院哲學所為事件的標記。同年12月全國醫學哲學的會議在廣州召開，會上著名的生命倫理學家、中國社會科學院哲學所邱仁宗研究員介紹了英語國家有關輔助生殖技術，腦死亡和安樂死及其他生命倫理學問題的爭議。1980年，《醫學與哲學》雜志創刊，邱仁宗研究員的開篇論文為“死亡和安樂死”。1987年，邱仁宗教授出版了《生命倫理學》一書，成為將美國和西方生命倫理學介紹到中國的開篇著作。1988年10月《中國醫學倫理學》創刊。1988年7月全國“安樂死倫理、法律、社會問題”研討會召開，1988年11月“人工授精的倫理，法律，社會問題全國會議”召開。上述兩本雜志的出版，兩個會議的討論，標志著大陸生命倫理學的正式開始。從1997年至今，大陸生命倫理學進入了“體制化”和“法規化”的新階段。更多的機構審查委員會（IRB）或醫學倫理委員會建立了起來，生命倫理學的研究更多集中在制訂符合生命倫理的政策和法規上。同時，也有許多學者試圖從中西方文化的傳統資源中尋找生命倫理學中國化的啟示，有所謂“儒家生命倫理學”、“道家生命倫理學”、“基督教生命倫理學”等學術探索和有益嘗試。

然而，客觀地分析生命倫理學的中國語境，有兩大問題癥候不可不察：一是缺少“對話”；二是不夠“關心”。前者突出地表現為，倫理學家、法學家和科學家往往各自以一種自說白話的“自信”來應對或解決難題，但并未真實地面對問題；后者突出地表現為，中國生命倫理學熱心于追蹤生命倫理前沿問題，對中國生命倫理的問題現狀缺乏調查研究的熱忱或者不夠“關心”，對中國醫療民生難題缺少足夠的關心，因而不能真正地立足于中國本土并面向中國問題。因此，在現代醫療技術對生命倫理及法律帶來的嚴峻挑戰中，中國生命倫理學面臨的更為緊迫而重大的難題是：如何在強調“對話實踐”和關注“中國問題”的基礎上，面對現代醫療技術中的倫理及法律難題，分析我們進行醫療抉擇的理由和治理方案，探索中國生命倫理面臨的困境和體系構建的路徑，并給出相關問題的國情調研或國情對策。這意味著，生命倫理學的中國難題亟需完成兩大語境的梳理：

其一是生命倫理學作為“對話的倫理學”的理念的確立?！皩υ挕崩砟畹暮诵?，是生命倫理學在跨學科的條件下，真實地面對現代醫療技術中的倫理及法律問題，推進倫理學家、法學家、科學家、醫生、政府主管部門以及公眾進入深層次對話與商談的學術旨趣或良知抉擇。因為，無法對話的、或者只是尋求獨自的生命倫理學，習慣了將現有的道德理論或權利理論（如道義論、后果論和四項原則或者附加原則）應用到現代醫療技術的倫理及法律問題的分析或解決上，往往使得倫理學家和法學家無法真正地溝通或理解，他們與科學家或醫療（衛生）政策的制訂者，亦存在著不利于對話或商談的知識“偏好”或學科“阻隔”，這不利于相關難題的梳理與解決。生命倫理學中國難題要完成語境梳理，首先必須作為融合或打通“人文價值世界”和“醫療技術世界”的對話實踐才是可行的；其“生命力”并不主要地在于探討某些備選原則的應用問題，（當然這些原則的討論同樣也是非常重要的）而是力圖在推進對話或商談實踐上有所作為，并在肅清問題或治理難題的基礎上探討我們如何應對現代醫療技術中的倫理、法律難題。

其二是生命倫理學的中國理念的確立和中國問題的應對。生命倫理學是在以問題或難題為取向的研究中產生和發展起來的，它在兩個視野上展開相關難題的分析與治理：一是與醫療民生相關；一是與醫療技術的最新進步相關。中國理念和中國問題，無疑是我國生命倫理學應對現代醫療技術中的倫理與法律難題的基本立足點。它在現代醫療技術之總體進展中，確定了面向中國醫療民生難題和中國技術進步難題的價值旨歸。因此，盡可能多地關注中國的醫療民生，以及盡可能多地針對中國問題的現狀進行調查研究，是中國生命倫理學的立身之本。

三、生命倫理學的中國形態及構建方向

一般意義上的生命倫理學是與生命科學和醫療技術相關聯的應用倫理學。然而，在當代漢語語境或者在生命倫理學面臨的中國難題的意義上，我們可以思考生命倫理學作為一種新型倫理形態（Ethictopology）的意義。一方面，中國語境將從一種倫理觀的意義上揭示生命倫理學的中國形態作為涵蓋生命科學、醫學、倫理學、法學、社會學等諸多學科的生態文化系統的本質，及其對重整人類性或民族性的倫理生活形態的醫療實踐運動的重要價值；另一方面，中國生命倫理的“形態”理念，將從總體上回應現代醫療技術在醫療實踐中帶來的世界性的倫理、法律和社會問題，實現一種立足于中國倫理現實和法律實踐對現代醫療技術進入倫理和法律的路徑辨識或探索，建構中國醫療技術的生命倫理體系，從原則和理論、問題和難題、政策和實踐三大向度建構倫理體系和法律解釋框架。從這一意義上看，中國生命倫理學的研究路徑，首先依賴于我們如何回到中國生命倫理的“道德鄉土”，以一種科學的調查研究的審慎性、精確性和實證性，捕捉中國生命倫理的問題境域及其客觀現實。我們過去關于醫療技術的生命倫理和法律研究，或者主要地關注抽象的理論思辨而缺乏現實關懷，或者著眼于具體境遇中的具體因素而缺乏整體架構，缺乏對相關主體或利害相關人的主觀倫理意愿的調查研究；而實際上，回歸中國語境的最初步伐，必然是以當代中國人對醫療技術問題的倫理意愿為核心進行的實證調查，這是一項為生命倫理的中國形態奠基的工作。在此基礎上，突破過去按照技術分類體系展開、以具體問題為直接對象、即時性的和碎片化的研究范式，建構一個將具體技術活動形態和歷史背景、價值觀念、道德意見、生活境遇、實踐者意愿、社會責任、法律規范以及未來發展訴求整合在一起的分析模式。進而，通過理論和實踐研究，在綜合醫療科技行為帶來的醫療倫理、法律和社會問題的基礎上，為中國未來醫療衛生事業和醫療技術的發展，有針對性地在調查研究的基礎上，在重大倫理難題和法律難題的治理和應對，以及道德文化建設、社會制度建設、立法與法治化建設，和未來發展總體戰略等方面，提供一系列的對策建議、理論論證和國情分析。

基于對生命倫理學的中國形態的一種理論預設和學術期待，我們多少能夠展望一下中國語境下的生命倫理學在其形態構建上亟待完善并著力建構的三大方向：

第一，宏觀視野上的突破。生命倫理學是一個包含了生物學、醫學、社會學、法學和倫理學等諸多學科，高度交叉與綜合的創新性研究系統，是以倫理學為主軸貫通自然科學、社會科學與人文學科三大領域，圍繞“現代醫療技術”、“生命的診治或加強”、“社會、法律、文化”三大關鍵論題展開的理論與實踐緊密結合的綜合型論題。生命倫理學的中國形態必須厘清這三大概念的區別、聯系及其各自的問題范圍。因此，宏觀視野的研究，主要是運用倫理學案例分析和道德哲學反思的方法，從多學科交叉融合的視野上基于對倫理難題與法律難題的領域界劃或治理機制的探索，分析研究現代醫療技術作為一種現代性的醫療一技術現象在醫療實踐中帶來的倫理難題和法律難題。倫理是在“道德原理”和“道德規范”的論證、辯護、反思和批判的意義上為法律的應用或立法實踐提供應然性之評判、正當性之理據和善的目標參照，它在“活的好”與“做的好”兩個方面關涉權利、義務和責任問題，并將之融合到道德論辯和法理依據的分析之中，為法律問題的解決，特別是立法實踐提供原理支持、原則辯護和價值引導；法律則是通過強制性的規范體系包括立法、判例和針對具體問題的司法解釋，體現倫理的價值、原理、原則和規范，它在強制性規范或判例的“適用”層面，以不容爭辯的形式關涉權利、義務和責任，面向行為或應用層面解決有關難題。而“現代醫療技術”作為人的“醫療技術行為”，將醫療技術變革與生命倫理突破以一種亙古未見的方式相互緊密關聯起來了，它凸顯了技術干預所進入的“從生到死”的生命之過程，以及“從身體到心靈”的生命之體系，從而在實踐上給醫療抉擇帶來了各種各樣棘手的倫理難題和法律難題。這一研究進路，并不僅僅是為了描述或者討論在技術發展、運用的具體過程中產生的具體的倫理和法律難題，而是將“現代醫療技術”視為一個動態演進的現代技術變革與人類醫療實踐相互融合的過程的基礎上，揭示技術活動與人類倫理生活和法律秩序之間的本質關聯，并在此基礎上去審視由于現代醫療技術所引發的一般社會問題、生命倫理難題和法律難題的產生根源、呈現形式和治理機制，為從理論上解決這些問題奠定邏輯和概念基礎。

第二，中國生命倫理狀況及法律問題的調查。生命倫理學的研究，在其本質上是對人類生存實踐活動的直接關照，因此，通過社會學的實證研究來發現當代中國醫療技術實踐中存在的問題，是理論研究和對策研究的必要基礎和基本前提。生命倫理學的中國形態及其構建路徑，其真實的開端處或起點處，乃在于我們運用社會學調查方法，比如通過文獻研究、深度訪談、問卷被試和現場考察等諸多路徑，獲取中國本土面臨的醫療科技的倫理及法律問題的數據庫和典型案例，以為進一步的綜合研究提供調查分析之依據。比如說，我們可以根據現代醫療技術中人與人之間或者人與物（或者以技術為中介）之間的權利、義務、責任和公正四大主題，設定相關問卷，對其中產生的生命倫理及其法律問題進行社會倫理狀況的調查，獲得中國本土（通過多群體分類調查）看待現代醫療技術及其應用的主觀意愿方面的第一手數據和案例。這將使生命倫理學的中國語境變得清晰、明確、有力，從而使得生命倫理學的語境梳理真正向中國的現狀和國情靠攏，找出中國問題的特殊難題。以醫療技術的生命倫理和法律的中國難題為例，可能有三種具體表現形式：普遍性問題，普遍性問題在中國語境中的特殊表現，以及發源于中國現實的特殊問題。我們如何對這些問題進行區分并加以科學的描述，清理出造成這些區別的中國歷史文化和現代社會生活條件，準確把握當代中國人的倫理、法律和醫療生活的真實狀況，以及我們如何認識、理解和應對這一生存境遇及其中蘊含的生活體驗和倫理意愿，決定了我們的生命倫理學研究開啟或者梳理中國語境的基本方式及其特有的學術品質。

第三，重大應用難題和前沿問題研究。生命倫理學的中國難題關涉諸多復雜艱巨的問題域或問題系列。在現代醫療技術的范例中，核心的問題軸線是以“生命倫理”為基點或主軸，通過倫理分析和法律分析力圖辨析或澄清醫療技術行為中面臨的權利、義務、責任和公正等方面的倫理難題、法律難題和倫理一法律難題。因此，生命倫理學的中國語境，除了要在宏觀理念研究的推進策略上根據倫理難題、法律難題、倫理一法律難題的問題軸線展開，還必須面對具體的重大應用難題和前沿問題，強調從“倫理觀念變革”的意義上理解現代醫療技術以及在倫理一法律難題的具體問題境遇中展開道德辯護、倫理分析和法律分析。這表明，我們在問題域和研究對象的劃分上，要通過綜合醫療技術行為對生命過程或生命體系的干預，以及醫療技術發展演進的邏輯線索，對現代醫療技術中的生命倫理的語境進行梳理。比如說，我們可以從兩大軸線上捕捉其中遭遇的重大應用難題或前沿問題：（1）在技術演進或變革的歷史軸線上，梳理出“常規治療技術”、“高新生命技術”和“涉及人類發展性需求的醫療技術”三大類；（2）在技術與人（醫療主體）相關的空間軸線上，梳理出與身體相關、與神經或心靈相關、與遺傳和世代相關三大類。由此，形成了一個由“時空交織”的問題網絡，并系統探討其內在倫理難題、法律難題和倫理一法律難題的立體性的應用難題和前沿問題?，F代醫療技術對人的生與死、身與心、遺傳與世代等至為根本的生命之過程和生命之體系進行操作、干預或控制，對現有的（包括傳統的）倫理觀與法律規范體系帶來了重大挑戰和沖擊。

四、生命倫理的道德前景與研究路徑

當代生命倫理學是一個涵蓋了生命科學技術、倫理學、哲學、法學、社會學和社會實踐活動的生命文化運動，生命倫理學及其原則（四原則）的討論就是在這一背景下展開的。在半個多世紀的探索中，國際生命倫理學的研究不斷地在道德論辯和法律解釋兩個維度對有“喬治頓咒語”（尊重、行善、無害和公平）之稱的規范體系提出了嚴肅的批評和質疑，生命倫理學的眾多研究成果都試圖對原則進行重新審查或補充。因此，以生命倫理為主軸，將道德理由（辯護和論辯）和法律依據的探討作為生命倫理體系的兩翼，突破現有的生命倫理學的進路，是生命倫理學面向中國問題或中國語境進行醫療抉擇和問題治理的必然選擇。中國生命倫理的道德前景，有賴于這種理論與實踐之良性互動的生命倫理運動之勃興，以及我國生命倫理學理論研究在進入或梳理自身語境時貫通宏觀與微觀、理論與實證、哲學論辯與難題治理等區隔或阻滯所具備的實踐智慧。

從這一意義上看，生命倫理學的中國難題，擇其要者而言，主要地是由一系列嵌入在當代中國醫療技術實踐中的倫理難題、法律難題和倫理一法律難題構成的，它本身預設或者預期了一個與中國醫療民生和醫療技術實踐密切關聯的生命文化運動（或生命倫理運動）的可能。生命倫理學的中國難題的展開及其研究范例的形成，從一種倫理形態的意義為中國生命倫理的道德前景指引著方向。它強調以中國生命倫理的理念，回應以生命科學技術和神經科學為主體的現代醫療技術在醫療實踐中帶來的世界性的倫理、法律和社會問題；強調在綜合醫療科技行為帶來的醫療倫理、法律和社會問題的基礎上，建構中國醫療技術的生命倫理體系。這意味著，一種著眼于生命倫理之道德前景的生命倫理學研究，必須格外重視其對中國未來醫療（衛生）事業發展之民生價值內涵的關注，所以既包括對實踐問題進行理性反思的研究，也包含對具體問題進行理論分析、論證和理論指導，以及在社會政策、制度和國家法治建設方面的指導策略，和面對具體實踐問題時所應采取的倫理和法律技術策略。因此，這是一個涵蓋了基本理念、理論邏輯、政策和制度設計、法律規范體系和具體行動技術策略，并以促進和改善中國未來生命科學技術體系、醫療衛生事業和社會和諧發展為最終目標的系統工程。

基于以上分析，我們認為，中國生命倫理學在研究路徑方面面臨三大轉型：

其一，以“對話”和“商談”的研究方法，推進生命倫理學的跨學科研究。我們在生命倫理學的中國難題的應對方略上倡導一種“對話”和“商談”的倫理學，用意乃在于：力圖使得“以問題為取向”的生命倫理學在一種跨學科對話和跨文化商談中，打破學科壁壘，打通人文價值世界和醫療技術世界的阻隔，以“對話倫理學”的交叉融合的視角，進行難題分析、現狀調查、問題治理，并提供指導醫療抉擇的對策建議，從而進一步推進生命倫理學的跨學科研究。我們知道，對當代生命倫理學而言，現代醫療技術所產生的生命倫理和法律問題，已不再是單個學科的事情，而是一個關涉多個學科的集群性問題，沒有多學科的共同介入和合作研究，人們無法真正回應這些重大的現實問題以及由之產生的諸種理論問題甚至文化問題。在強調多學科的共同合作和研究的同時，運用對話和商談的研究方法，力圖打破原有的學科界限，在眾多相關交叉研究視域中（比如醫學倫理、醫學社會學、醫事法學、倫理社會學、法倫理等）進行問題分析和理論探析，這不但能改變以前各學科各自為伍、單兵作戰的“獨白敘事”的狀況，促進學科交叉與融合，還能形成以問題為中心的多學科研究方法，形成一種跨學科的研究進路。

其二，以對“問題”或“難題”的充分關注，推進生命倫理學的跨文化研究。生命倫理學從其誕生之日起就被界定為：運用種種倫理學方法，在跨學科的條件下，對生命科學和醫療保健的倫理學維度，包括道德見解、決定、行動、政策，進行系統研究的學問。以問題為取向的研究路徑，在生命倫理學和醫事法學的研究進展中，在根本上顛覆原有的關于理論與實踐、思想與世界的關系的傳統認識，它使得生命倫理學總是在一種倫理突破的意義上，著意去介入、去發現或者重建一種生機勃勃的倫理生活及法律秩序的可能性。在這個意義上，中國醫療技術的生命倫理學和法學的應用研究，既是世界倫理學形態整體變革之大潮的一個組成部分，也是我們創建新的、順應世界潮流而又具有中國特色的中國倫理文化運動的一個具體實踐環節。雖然今天的生命倫理學理念主要是發端于西方文化傳統之中，但由于生命倫理學問題往往對任何文化來說都是難題，生命倫理事件的全人類性和前沿性使得任何一個國家的文化傳統都不能獨善其身，也無法僅僅在自己的話語體系中提供一個可以被普遍接受的解決方案，故而取消了任何一種特殊文化的話語霸權。因此，以問題或難題為取向的生命倫理學研究，最有希望提供一個跨文化的倫理視野和論辯平臺，使不同觀點可以在生命倫理實踐中更平等、更自由、更深刻地進行對話交流，在屬于全人類的范疇內進行廣泛的合作；在這些事件的啟發下重新審視我們的整個道德體系，判斷、描述并引導我們未來生活的應然。