細(xì)胞增殖論文精選(九篇)

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第1篇：細(xì)胞增殖論文范文

【摘要】文章對(duì)生產(chǎn)制造企業(yè)價(jià)值鏈及價(jià)值鏈分析理論進(jìn)行總結(jié),指出價(jià)值鏈分析在制造企業(yè)內(nèi)部物流成本管理中的運(yùn)用有極強(qiáng)的優(yōu)越性。

【關(guān)鍵詞】?jī)r(jià)值鏈分析;制造企業(yè);內(nèi)部物流成本管理;運(yùn)用

物流成本作為企業(yè)“第三利潤(rùn)源泉”,倍受各方的關(guān)注。物流成本管理的意義在于:通過(guò)對(duì)物流成本的有效把握,利用物流要素之間效益背反關(guān)系,科學(xué)、合理地組織物流活動(dòng),加強(qiáng)對(duì)物流活動(dòng)過(guò)程中費(fèi)用支出的有效控制,降低物流活動(dòng)中的物化勞動(dòng)和活勞動(dòng)的消耗,從而達(dá)到降低物流總成本,提高企業(yè)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益的目的。

目前,造成中國(guó)物流成本居高不下的關(guān)鍵因素是制造業(yè),困擾商品流程優(yōu)化的還是制造業(yè)。為了提高制造業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力,要求從業(yè)人員能夠?qū)υ牧稀氤善贰a(chǎn)成品以及相關(guān)的信息流動(dòng)做到7R,即正確的產(chǎn)品、正確的質(zhì)量、正確的條件、正確的顧客、正確的地方、正確的時(shí)間、正確的成本。這也正是現(xiàn)代物流管理的實(shí)質(zhì)。制造企業(yè)的物流成本管理中引入價(jià)值鏈理論,能對(duì)企業(yè)內(nèi)部物流作業(yè)流程進(jìn)行持續(xù)改善,以消除不必要的作業(yè);通過(guò)對(duì)物流成本進(jìn)行評(píng)價(jià),分析確立物流成本控制環(huán)節(jié),有利于幫助企業(yè)降低物流作業(yè)成本。

一、價(jià)值鏈及價(jià)值鏈分析方法

信息技術(shù)的廣泛應(yīng)用,使企業(yè)從價(jià)格競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)和個(gè)體競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)向價(jià)值競(jìng)爭(zhēng)、服務(wù)競(jìng)爭(zhēng)和網(wǎng)絡(luò)競(jìng)爭(zhēng),而持續(xù)的核心競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)對(duì)于企業(yè)后一種情況的競(jìng)爭(zhēng)具有更加重要的戰(zhàn)略意義。價(jià)值鏈作為確定企業(yè)核心競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的一種基本工具應(yīng)運(yùn)而生。它是一種系統(tǒng)性研究企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的方法,其核心內(nèi)容是分解企業(yè)價(jià)值鏈、確定價(jià)值活動(dòng)成本,以價(jià)值最大化為目標(biāo)重構(gòu)價(jià)值鏈,建立其優(yōu)化結(jié)構(gòu),從而提升企業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。價(jià)值鏈的優(yōu)化研究經(jīng)歷了從邁克爾·波特的傳統(tǒng)價(jià)值鏈、Peter·Hines的“集成物料價(jià)值的運(yùn)輸線”、JefferyF1Rayport和JohnJ1Sviokla的虛擬價(jià)值鏈,再到價(jià)值網(wǎng)理論的一個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程。

價(jià)值鏈已經(jīng)發(fā)展成為當(dāng)代網(wǎng)絡(luò)經(jīng)濟(jì)環(huán)境下的一種組織戰(zhàn)略思想和模式,它是以企業(yè)儲(chǔ)運(yùn)、生產(chǎn)、銷售、服務(wù)等業(yè)務(wù)流程為載體,以實(shí)現(xiàn)顧客價(jià)值最大化為直接目標(biāo)而形成的企業(yè)內(nèi)部?jī)r(jià)值活動(dòng)的系統(tǒng)性結(jié)構(gòu),為企業(yè)形成信心競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)、創(chuàng)造長(zhǎng)期利潤(rùn)提供了一種系統(tǒng)的、動(dòng)態(tài)的分析方法。

(一)生產(chǎn)制造企業(yè)的價(jià)值鏈

現(xiàn)代企業(yè)管理思想認(rèn)為企業(yè)是一個(gè)為最終滿足顧客需要而設(shè)計(jì)的一系列作業(yè)的集合體,企業(yè)本身就是一個(gè)由此及彼、由內(nèi)到外的作業(yè)鏈,每完成一項(xiàng)作業(yè)要消耗一定的資源,而作業(yè)的產(chǎn)生又形成一定的價(jià)值,轉(zhuǎn)移到下一個(gè)作業(yè),依此轉(zhuǎn)移,直至形成最終產(chǎn)品,提供給企業(yè)外部顧客。而最終產(chǎn)品作為企業(yè)內(nèi)部作業(yè)鏈的最后一環(huán),凝結(jié)了各個(gè)作業(yè)鏈所形成并最終提供給顧客的價(jià)值。因此,作業(yè)鏈同時(shí)又表現(xiàn)為價(jià)值鏈,作業(yè)耗費(fèi)與作業(yè)產(chǎn)出配比的結(jié)果,就是企業(yè)的盈利。價(jià)值鏈由多個(gè)作業(yè)組成,價(jià)值鏈內(nèi)信息的傳遞基本上具有雙向特征。根據(jù)價(jià)值鏈各個(gè)環(huán)節(jié)的特征,價(jià)值鏈可分為外部?jī)r(jià)值鏈和內(nèi)部?jī)r(jià)值鏈。外部?jī)r(jià)值鏈包括企業(yè)、供應(yīng)商、客戶等;內(nèi)部?jī)r(jià)值鏈主要包括生產(chǎn)活動(dòng)的作業(yè)活動(dòng)等。

(二)內(nèi)部?jī)r(jià)值鏈分析

低成本是企業(yè)取得任何競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的有利保障。企業(yè)應(yīng)在營(yíng)造企業(yè)核心競(jìng)爭(zhēng)力的前提下,對(duì)內(nèi)部?jī)r(jià)值鏈進(jìn)行分析,主要是為了解決降低企業(yè)內(nèi)部成本問(wèn)題。而這些分析工作都是以“作業(yè)”為中心,在整個(gè)過(guò)程中還須結(jié)合事前管理的統(tǒng)籌規(guī)劃、事中管理的實(shí)時(shí)控制和事后管理的分析考評(píng),以確認(rèn)企業(yè)的價(jià)值活動(dòng)有哪些,處于什么樣的分布狀態(tài),并將每個(gè)價(jià)值活動(dòng)所耗費(fèi)的成本與對(duì)產(chǎn)品價(jià)值的貢獻(xiàn)相比較,根據(jù)企業(yè)各個(gè)作業(yè)活動(dòng)在價(jià)值增值中的不同作用,將其進(jìn)行細(xì)分并采取措施加以改進(jìn)。

內(nèi)部?jī)r(jià)值鏈分析是將從基本的原材料到企業(yè)最終用戶之間的價(jià)值鏈分解成作業(yè)活動(dòng),以便理解成本的性質(zhì)和差異產(chǎn)生的原因,通過(guò)差別分析和成本分析,找出企業(yè)在價(jià)值生產(chǎn)過(guò)程中的利弊。企業(yè)為了實(shí)現(xiàn)其“股東價(jià)值最大化”的經(jīng)營(yíng)目標(biāo),必須提高其作業(yè)產(chǎn)出,減少作業(yè)耗費(fèi),但并非所有的作業(yè)都能夠創(chuàng)造價(jià)值,這就需要溯本求源,分析哪些作業(yè)能夠增加價(jià)值,哪些作業(yè)不能增加價(jià)值,并盡可能消除不能創(chuàng)造價(jià)值的作業(yè),即使能創(chuàng)造價(jià)值的作業(yè),也應(yīng)盡可能減少其作業(yè)耗費(fèi),這一切都要借助于作業(yè)分析。為此,作業(yè)管理(Activity-basedManagement簡(jiǎn)稱ABM)作為一種現(xiàn)代企業(yè)管理方法由此產(chǎn)生,作業(yè)分析主要過(guò)程如下:

1.確定作業(yè)。確定企業(yè)的價(jià)值生產(chǎn)過(guò)程,根據(jù)作業(yè)對(duì)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的貢獻(xiàn)大小區(qū)分作業(yè),從而確定產(chǎn)品或服務(wù)的總成本構(gòu)成。

2.評(píng)估作業(yè)。識(shí)別各過(guò)程的中間環(huán)節(jié),從而確定獲得相關(guān)成本優(yōu)勢(shì)的機(jī)遇。每項(xiàng)物流作業(yè)之間不是完全獨(dú)立的,在同一條價(jià)值鏈上是相互依賴的。例如,企業(yè)產(chǎn)品制造的實(shí)現(xiàn)必須依賴于原材料的儲(chǔ)備以及運(yùn)輸,而這種相互之間的依賴性有時(shí)也會(huì)造成一些不必要的重復(fù)操作,從而影響整體的效率以及效益。因此,通過(guò)價(jià)值鏈分析法辨別出冗余環(huán)節(jié),按各個(gè)作業(yè)活動(dòng)在價(jià)值增值中的作用不同,將其細(xì)分為直接增值作業(yè)活動(dòng)、輔助增值作業(yè)活動(dòng)、非增值作業(yè)活動(dòng)和逆增值作業(yè)活動(dòng),從而確定價(jià)值創(chuàng)造過(guò)程中的核心環(huán)節(jié)。

3.優(yōu)化作業(yè)。通過(guò)對(duì)作業(yè)活動(dòng)的評(píng)估,擬定改進(jìn)方案。對(duì)于直接增值作業(yè)活動(dòng),應(yīng)在保持其增值效果不降低的前提下,盡可能提高運(yùn)行效率,減少資源耗費(fèi)和占用;對(duì)于輔助增值作業(yè)活動(dòng),有必要在維持其輔助作用不變的情況下,盡可能減少資源占用;對(duì)于非增值作業(yè)活動(dòng)和逆增值作業(yè)活動(dòng),則應(yīng)盡可能減少和避免,達(dá)到優(yōu)化作業(yè)的目的。

同時(shí),管理深入到作業(yè)水平,進(jìn)行作業(yè)分析,就要求變革傳統(tǒng)的成本計(jì)算,使其與之相適應(yīng),即要求成本計(jì)算深入到每一作業(yè),進(jìn)行作業(yè)成本計(jì)算。由此,基于企業(yè)價(jià)值鏈的作業(yè)成本法應(yīng)運(yùn)而生。

二、價(jià)值鏈分析在制造企業(yè)內(nèi)部物流成本管理中的運(yùn)用

對(duì)于生產(chǎn)制造型企業(yè)來(lái)講,生產(chǎn)制造賦予了最終商品的大部分價(jià)值,是企業(yè)的核心業(yè)務(wù)單元。另外,現(xiàn)代的制造型企業(yè)在不斷加大生產(chǎn)力度的同時(shí)也十分注重客戶的售后服務(wù),不斷加大其在產(chǎn)品價(jià)值增值過(guò)程中的作用,從而逐漸地形成企業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力。

企業(yè)的物流過(guò)程從價(jià)值鏈角度分析,不但有利于節(jié)省自身的業(yè)務(wù)運(yùn)作時(shí)間、合理利用資源,而且有利于為最終的顧客提供最有價(jià)值的服務(wù),在企業(yè)的物流鏈上找到價(jià)值增值過(guò)程中貢獻(xiàn)最大的核心環(huán)節(jié)。同時(shí),利用價(jià)值鏈分析法企業(yè)的物流活動(dòng)也不再簡(jiǎn)單地以全面削減成本為目的,而是在各價(jià)值生產(chǎn)過(guò)程中降低成本、提高效率。

制造業(yè)企業(yè)內(nèi)部物流主要包括:供應(yīng)物流,即上游企業(yè)對(duì)本企業(yè)所需物資供應(yīng)的物流活動(dòng);原材料、零配件部件物流,即企業(yè)內(nèi)部所需要原材料、零配件部件從供應(yīng)倉(cāng)庫(kù)或者上游企業(yè)直接供應(yīng)到生產(chǎn)線的物流活動(dòng);半成品物流,即生產(chǎn)過(guò)程中的半成品從上一道工序(或車間)到下一道工序(或車間)的物流活動(dòng);產(chǎn)成品物流,即生產(chǎn)出的成品或最終產(chǎn)品,從生產(chǎn)線到產(chǎn)成品倉(cāng)庫(kù)或者直接到下游企業(yè)的物流活動(dòng);回收物流,即生產(chǎn)過(guò)程中的廢棄物丟棄或再生所發(fā)生的物流活動(dòng)。

內(nèi)部物流的合理化可以促進(jìn)生產(chǎn)過(guò)程中資源配置的合理化和工藝流程的合理化,從而大大提高制造業(yè)企業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力。目前,許多企業(yè)已經(jīng)開(kāi)始意識(shí)到內(nèi)部物流管理對(duì)于降低成本、提高物流效益,改善企業(yè)管理的重要作用,紛紛優(yōu)化企業(yè)內(nèi)部物流管理,建立內(nèi)部物流部門,對(duì)訂單、庫(kù)存、運(yùn)輸、倉(cāng)儲(chǔ)、加工等物流各環(huán)節(jié)或全過(guò)程實(shí)施高效的管理計(jì)劃和控制,促進(jìn)企業(yè)可持續(xù)發(fā)展,增強(qiáng)企業(yè)核心競(jìng)爭(zhēng)力。

但現(xiàn)有企業(yè)內(nèi)部的物流管理存在著許多軟肋與制約:

一是傳統(tǒng)的管理理念、機(jī)制、方式等影響企業(yè)內(nèi)部物流效率的提高。轉(zhuǎn)二是企業(yè)內(nèi)部物流環(huán)節(jié)縱、橫向聯(lián)合薄弱。

三是物流成本核算缺乏財(cái)務(wù)標(biāo)準(zhǔn),責(zé)任主體不清,物流管理效益難以凸現(xiàn)。

四是對(duì)現(xiàn)代物流的研究較滯后,缺乏專業(yè)人才,實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)少等。

三、基于價(jià)值鏈分析方法的優(yōu)越性

基于價(jià)值鏈分析的成本觀是成本管理從價(jià)值保證和價(jià)值增加兩個(gè)視角來(lái)進(jìn)行的。由此,價(jià)值鏈成本管理實(shí)際上也就具有了雙重的性質(zhì):一是控制資源的必要而足夠的投入,從而保證顧客價(jià)值(表現(xiàn)為保證提供合格產(chǎn)品);二是控制資源的耗費(fèi),以提供盡可能多的顧客價(jià)值(表現(xiàn)在保證質(zhì)量前提下的較低價(jià)格)。

通過(guò)價(jià)值鏈分析,對(duì)外能識(shí)別并確保企業(yè)在行業(yè)或產(chǎn)業(yè)中的優(yōu)勢(shì)地位和核心地位,從而能夠在整體價(jià)值鏈顧客價(jià)值最大化的前提下,通過(guò)價(jià)值讓渡等方式結(jié)成戰(zhàn)略聯(lián)盟而形成優(yōu)勢(shì)價(jià)值鏈聯(lián)盟,以使企業(yè)確保自身的優(yōu)勢(shì)戰(zhàn)略定位;對(duì)內(nèi)運(yùn)用價(jià)值鏈分析法來(lái)考察企業(yè)各項(xiàng)活動(dòng)及其相互關(guān)系,能夠盡可能消除不增加價(jià)值的作業(yè),降低可增加價(jià)值作業(yè)的資源消耗,能更全面地分析企業(yè)成本的構(gòu)成,從而避免使用傳統(tǒng)成本管理方法的缺陷。

因此,基于價(jià)值鏈的成本管理具有以下優(yōu)勢(shì):

(一)充分考慮了降低成本的相對(duì)性問(wèn)題

成本的降低有絕對(duì)成本降低和相對(duì)成本降低之分。絕對(duì)成本降低是通過(guò)一定的途徑使成本的發(fā)生額低于一定的水平(標(biāo)準(zhǔn)或預(yù)算);相對(duì)成本降低是將成本與作業(yè)的質(zhì)量、效率以至最終與企業(yè)效益聯(lián)系起來(lái),它并不單純追求成本絕對(duì)額的降低,而是追求成本效益的不斷提高。

(二)抓住了成本管理的關(guān)鍵即作業(yè)問(wèn)題

基于價(jià)值鏈的成本管理從研究導(dǎo)致成本發(fā)生的作業(yè)及作業(yè)結(jié)構(gòu)開(kāi)始,通過(guò)對(duì)作業(yè)及作業(yè)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化、改造來(lái)達(dá)到提高成本效益的目的,因而這種成本管理抓住了成本問(wèn)題的關(guān)鍵。

(三)擴(kuò)大了傳統(tǒng)成本管理的控制范圍

基于價(jià)值鏈的成本管理在研究成本問(wèn)題時(shí)不僅要考察生產(chǎn)作業(yè),還要考察非生產(chǎn)作業(yè);不僅考察基本作業(yè),還要考察輔助作業(yè);不僅要考察本企業(yè)的價(jià)值鏈,而且要考察競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手、供應(yīng)商、銷售渠道、顧客甚至整個(gè)行業(yè)的價(jià)值鏈,以尋求廣泛提高本企業(yè)成本效益的途徑。

(四)更為全面地考慮了成本管理中的相關(guān)問(wèn)題

基于價(jià)值鏈的成本管理追求的是整個(gè)價(jià)值鏈效益的優(yōu)化,這就要求成本管理須正確處理作業(yè)與作業(yè)之間,業(yè)務(wù)流程與業(yè)務(wù)流程之間,本企業(yè)價(jià)值鏈與供應(yīng)商、銷售渠道之間的關(guān)系;要求通過(guò)優(yōu)化這些關(guān)系來(lái)提高整個(gè)價(jià)值鏈的效益,而不能為獲得局部利益損害整體利益,也不能為了短期利益而損害長(zhǎng)期利益。

【參考文獻(xiàn)】

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第2篇：細(xì)胞增殖論文范文

MAPK信號(hào)通路在多種惡性腫瘤（包括卵巢癌）細(xì)胞的增殖、凋亡和化療藥物作用及化療藥物耐受發(fā)生中起重要作用[4-6]。MAPK家族包括p38 MAPK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）等多個(gè)亞家族。這些亞族組成多條信號(hào)通路，其中最主要的有P38途徑、ERK1/2途徑和JNK途徑。MAPK家族成員被磷酸化激活后，將細(xì)胞外的各種刺激信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡及對(duì)藥物的敏感性[7]。有研究發(fā)現(xiàn)激活的AKT和MAPK，依次磷酸化BAD和BCL-2，進(jìn)而削弱鉑類和紫杉烷的促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[8]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路在晚期上皮性卵巢癌組織中異常激活，并發(fā)現(xiàn)磷酸化p38 MAPK在耐藥卵巢癌組織中表達(dá)較非耐藥卵巢癌組織中升高。

二甲雙胍是一種用于治療2型糖尿病的雙胍類降糖藥，最近兩項(xiàng)大型流行病學(xué)調(diào)查研究表明：長(zhǎng)期服用二甲雙胍能夠降低卵巢癌的發(fā)病率，而且二甲雙胍能夠顯著延長(zhǎng)卵巢癌合并糖尿病患者的無(wú)進(jìn)展生存期[9]。二甲雙胍通過(guò)STK11（也稱LKB1）激活A(yù)MPK，激活過(guò)程涉及多個(gè)參與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)的信號(hào)通路，其中包括MAPK信號(hào)通路[10]。但二甲雙胍是否能夠增加化療藥物對(duì)卵巢癌細(xì)胞的敏感性及相關(guān)的作用機(jī)制研究尚屬空白。

本研究首先觀察二甲雙胍對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響，以及二甲雙胍是否可增強(qiáng)順鉑的化療敏感性，并通過(guò)檢測(cè)二甲雙胍對(duì)化療藥物相關(guān)的重要信號(hào)通路MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用來(lái)探討相關(guān)的作用機(jī)制。以期尋找能提高卵巢癌化療敏感性的新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和試劑 人卵巢漿液性狀囊腺癌細(xì)胞系SKOV3，中、高分化，貼壁生長(zhǎng)，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞系常規(guī)3～5 d傳代。兔抗人p38 MAPK多克隆抗體、兔抗人P-p38 MAPK單克隆抗體；兔抗人AMPK多克隆抗體、兔抗人P-AMPK單克隆抗體，兔抗人GAPDH單克隆抗體購(gòu)自Cell signaling公司；二甲雙胍、順鉑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；Western blotting檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司；Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；BrdU標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司。

1.2 方法

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的情況 二甲雙胍能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，并且這種抑制作用能夠被Compound C所削弱。隨著二甲雙胍濃度（1×10-3 mol/L，1×10-4 mol/L，1×10-5 mol/L）的增加，其對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)（*P<0.05，**P<0.01）。其中1×10-4 mol/L

和1×10-5 mol/L的二甲雙胍能夠顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。而AMPK阻斷劑Compound C（5×10-7 mol/L，1×10-6 mol/L）均可削弱二甲雙胍的這種抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的作用。1×10-6 mol/L Compound C與二甲雙胍聯(lián)合應(yīng)用，其對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 二甲雙胍能夠增強(qiáng)卵巢癌對(duì)順鉑的敏感性 將不同濃度的順鉑（1、2、4、6 ng/L）加入卵巢癌細(xì)胞SKOV3中，加入或者不加入0.1 mM二甲雙胍孵育細(xì)胞48 h后，結(jié)果表明：0.1 mM的二甲雙胍聯(lián)合順鉑（1、2、4、6 ng/mL）作用于卵巢癌細(xì)胞時(shí)，順鉑抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用顯著增強(qiáng)（P<0.05）。其中6 ng/mL順鉑聯(lián)合0.1 mM的二甲雙胍對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用最顯著（P<0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 二甲雙胍聯(lián)合p38 MAPK阻斷劑SB203580能夠增強(qiáng)二甲雙胍的抗卵巢癌細(xì)胞增殖的作用 單獨(dú)應(yīng)用SB203580（5[dylw.net提供專業(yè)寫作論文和服務(wù).]、10 ?M）能抑制卵巢癌SKOV3的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。二甲雙胍（0.1 mM）和SB203580（5、10 ?M）聯(lián)合應(yīng)用對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的抑制作用顯著增強(qiáng)（*P<0.05，**P<0.01）。其中0.1 mM二甲雙胍與10 ?M p38 MAPK阻斷劑SB203580聯(lián)合應(yīng)用對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的抑制作用最顯著（**P<0.01），見(jiàn)圖3。

2.4 二甲雙胍激活A(yù)MPK信號(hào)通路，并抑制MAPK信號(hào)通路 二甲雙胍（10、20 mM）作用卵巢癌細(xì)胞SKOV3 6 h后，磷酸化AMPK水平顯著增高，且升高的磷酸化AMPK水平能夠被AMPK阻斷劑Compound C所削弱。經(jīng)二甲雙胍（1、10 mM）處理后，卵巢癌細(xì)胞SKOV3中磷酸化p38 MAPK蛋白水平顯著降低，見(jiàn)圖4。

3 討論

最近兩項(xiàng)大型流行病學(xué)資料顯示：（1）長(zhǎng)期服用二甲雙胍可降低卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；（2）在合并糖尿病的卵巢癌患者中，服用二甲雙胍的患者較未服用患者的無(wú)病進(jìn)展存活率顯著增加[10-11]。筆者研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，這種作用是通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。AMP激活蛋白激酶（AMPK）是主要的細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器，是代謝和腫瘤互相作用的主要調(diào)節(jié)子[11]。二甲雙胍以一種非胰島素介導(dǎo)的方式直接調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK，激活的AMPK調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路，其中包括mTOR和MAPK信號(hào)通路，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。

化療藥物引起的細(xì)胞損傷主要是通過(guò)、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，并且化療藥物耐受的形成也與MAPK信號(hào)通路激活密切相關(guān)[6]。MAPK家族包括P38MAPK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）等多個(gè)亞家族。這些亞族組成多條信號(hào)通路，其中最主要的有P38途徑、ERK1/2途徑。MAPK信號(hào)通路在多種惡性腫瘤（包括卵巢癌）細(xì)胞的增殖、凋亡和化療耐藥產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]。MAPK家族成員被磷酸化激活后，將細(xì)胞外的各種刺激信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)激活的MAPK，依次磷酸化BAD和BCL-2，進(jìn)而削弱鉑類和紫杉烷的促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生抵抗[12]。筆者的研 究結(jié)果表明：二甲雙胍可能通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制MAPK信號(hào)通路來(lái)抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的。這與以上研究結(jié)果相一致。

筆者的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：二甲雙胍（0.1 mM）能夠增強(qiáng)順鉑抑制卵巢癌細(xì)胞增殖作用。與最近的幾項(xiàng)研究結(jié)果一致：二甲雙胍能改善乳腺癌化療耐藥，并且發(fā)現(xiàn)二甲雙胍的這種對(duì)化療耐藥的調(diào)節(jié)作用是通過(guò)激活A(yù)MPK實(shí)現(xiàn)的[13]。Tseng等[16]在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍不僅能夠降低紫杉醇誘導(dǎo)p38 MAPK介導(dǎo)的切除修補(bǔ)基因（ERCC1）的表達(dá)，還能夠增加紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)。另外在肺癌、乳腺癌和前列腺癌裸鼠體內(nèi)模型中，二甲雙胍能夠顯著增強(qiáng)順鉑、紫杉醇和多柔比星對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并且二甲雙胍能夠減少多柔比星的用量，延長(zhǎng)疾病緩解期[14-15]。但這些結(jié)果說(shuō)明二甲雙胍可能通過(guò)激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

筆者同時(shí)發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍聯(lián)合MAPK信號(hào)通路抑制劑能夠增強(qiáng)二甲雙胍的抗腫瘤作用。p38 MAPK、p42 MAPK信號(hào)通路抑制劑可增加二甲雙胍和紫杉醇的抗腫瘤作用[16]。Liu等[17]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍和mTOR抑制劑（RAD001）聯(lián)合可增強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞毒作用，聯(lián)合應(yīng)用二甲雙胍、化療藥物和mTOR阻斷劑能夠[dylw.net提供專業(yè)寫作論文和服務(wù).]協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。Monteagudo等[18]在前列腺癌細(xì)胞中，p42 MAPK siRNA能夠顯著增強(qiáng)二甲雙胍的抗腫瘤作用。因此，鉑、紫杉醇化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合二甲雙胍和信號(hào)通路阻斷劑可能會(huì)增強(qiáng)卵巢癌化療的療效，這些研究結(jié)果都與筆者的研究結(jié)果一致。

總之，二甲雙胍能夠提高卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，并且這種作用是依賴于AMPK激活的；p38 MAPK阻斷劑SB203580也能夠抑制SKOV3的增殖，二甲雙胍能夠增強(qiáng)這種抑制作用。二甲雙胍的這種增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的作用可能是通過(guò)激活A(yù)MPK，從而抑制MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。筆者的研究結(jié)果為臨床應(yīng)用二甲雙胍及MAPK信號(hào)通道阻斷劑來(lái)提高卵巢癌化療藥物的敏感性提供理論支持，為卵巢癌的臨床聯(lián)合用藥提供新思路。

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第3篇：細(xì)胞增殖論文范文

論文摘要 目的：探討糖尿病足中醫(yī)辨證分型與血管細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原的表達(dá)差異。方法：對(duì)32例截肢的糖尿病足患者按中醫(yī)辨證分為氣血兩虛瘀阻證、脈絡(luò)瘀熱證、脈絡(luò)熱毒證和氣陰兩虛瘀阻證，分別對(duì)其截肢肢體的脛后動(dòng)脈應(yīng)用免疫組化法對(duì)細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原（Ki67）的表達(dá)進(jìn)行觀察、分析。結(jié)果：Ki67的陽(yáng)性表達(dá)與糖尿病足動(dòng)脈硬化閉塞程度呈負(fù)相關(guān)，與血管炎癥病變程度呈正相關(guān)。結(jié)論：炎癥在糖尿癥的大血管病變的過(guò)程中起到了重要的作用。

糠尿病足是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，據(jù)統(tǒng)計(jì)1996年全球糖尿病患者1．2億，預(yù)計(jì)到2025年，將達(dá)到2．5億以上，而大約15％的糖尿病患者將在其生活的某一時(shí)間發(fā)生足潰瘍或壞疽[1]。目前對(duì)于糖尿病足病因及發(fā)病機(jī)制雖然還不是完全清楚，但大家公認(rèn)糖尿病合并大血管病變導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病足發(fā)病的最主要因素。現(xiàn)將2004年10月～2005年5月間我們收治的32例糖尿病足患者的截肢動(dòng)脈標(biāo)本的血管細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原(Ki67)與其中醫(yī)辨證分型的相關(guān)性研究情況報(bào)告如下。

1 臨床資料

1．1 一般資料：32例均為天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院和天津中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2004年10月～2005年5月間的住院患者，其中男性24例，女性8例；年齡50～86歲，平均年齡69．2歲；糖尿病病程最長(zhǎng)30年，最短6年，平均18±2．4年。

1．2 診斷標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病足的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)會(huì)第二屆糖尿病足會(huì)議所制訂的“糖尿病足(肢端壞疽)檢查方法及診斷標(biāo)準(zhǔn)”。

1．3 截肢標(biāo)準(zhǔn)：參照國(guó)際糖尿病足工作組編寫的《糖尿病足國(guó)際共識(shí)》中關(guān)于“大截肢的定義、標(biāo)準(zhǔn)和指標(biāo)”[2]執(zhí)行。

1．4 中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)：參照《中醫(yī)外科學(xué)(第七版)》及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則·脫疽》之中醫(yī)辨證分型方案分為氣陰兩虛瘀阻證、脈絡(luò)瘀熱證、氣血兩虛瘀阻證、脈絡(luò)熱毒證四型。

2 觀察方法

2．1 標(biāo)本取材：壞疽截肢標(biāo)本32例，其中按中醫(yī)辨證分型氣血兩虛瘀阻組10例，脈絡(luò)瘀熱組10例，氣陰兩虛瘀阻組4例，脈絡(luò)熱毒組8例，取各例標(biāo)本下肢脛后動(dòng)脈。標(biāo)本經(jīng)過(guò)10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，備用。

2．2 設(shè)備、試劑：美國(guó)PENGUIN-600CL自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原(Ki67)抗體PV9000試劑盒DAB購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司。

2．3 免疫組織化學(xué)法：標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，采用PV法進(jìn)行免疫組化染色，染色過(guò)程嚴(yán)格按試劑盒染色程序進(jìn)行，選取已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。觀察細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原(Ki67)，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色細(xì)顆粒狀于細(xì)胞核表達(dá)，采用美國(guó)PENGUIN-600CL圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，選取病變處每500個(gè)細(xì)胞Ki67的陽(yáng)性表達(dá)率作為其陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS10．0軟件包進(jìn)行方差分析。

3 結(jié)果

3．1 中醫(yī)各證型所占比例以及年齡、性別分布：各證型比例，氣血兩虛瘀阻組10例（31．25%），脈絡(luò)瘀熱組10

例（31．25%），氣陰兩虛瘀阻組4例（12．5%），脈絡(luò)熱毒組8例（25．0%）。年齡、性別分布情況，見(jiàn)表1。

表1 32例患者年齡、性別分布 n（%）

性別n50~60歲61~70歲71~80歲80歲以上男24（ 75．0）4（12．5） 8（25．0）11（34．4）1（3．1）女 8（ 25．0）1（ 3．1） 3（ 9．3） 4（12．5）0 總計(jì)32（100．0）5（15．6）11（34．4）15（46．9）1（3．1）3．2 免疫組織化學(xué)法觀察各證型Ki67表達(dá)差異：具體情況見(jiàn)表2。

表2 各證型Ki67陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)比較 （%）

證型Ki67陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)脈絡(luò)熱毒 4．87±1．01*氣陰兩虛瘀阻1．86±0．47脈絡(luò)瘀熱1．49±0．13氣血兩虛瘀阻0．30±0．18注：與氣血兩虛瘀阻型比較，*P

氣血兩虛瘀阻證、脈絡(luò)熱毒證、脈絡(luò)瘀熱證、氣陰兩虛瘀阻證中均可見(jiàn)部分細(xì)胞Ki67呈陽(yáng)性表達(dá)，在脈絡(luò)熱毒證中表達(dá)指數(shù)最高，氣血兩虛瘀阻證中表達(dá)指數(shù)最低，二者比較具有顯著性差異(P

4 討論

Ki67抗原為細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原，分子量為345kd和395kd，其編碼基因位于第10號(hào)染色體上。Ki67的表達(dá)出現(xiàn)于G1中期到晚期，S期和G2期逐漸增加，有絲分裂期達(dá)高峰，分裂后迅速降解或丟失抗原決定簇，到G0期則不表達(dá)，半衰期為lh或更短[3]。有人認(rèn)為它可能是具有蛋白結(jié)合特性的重要結(jié)構(gòu)，在有絲分裂中起著維持DNA規(guī)則結(jié)構(gòu)的重要作用[4]，是一個(gè)反映細(xì)胞增殖的敏感指標(biāo)。

在糖尿病足的不同辨證分型中氣血兩虛瘀阻證、脈絡(luò)熱毒證、脈絡(luò)瘀熱證、氣陰兩虛瘀阻證中Ki67表達(dá)均呈陽(yáng)性，在脈絡(luò)熱毒證中表達(dá)最強(qiáng)、氣血兩虛瘀阻證中表達(dá)最弱，二者相比具有顯著性差異(P＜0．05)。根據(jù)Ki67陽(yáng)性指數(shù)可以判斷細(xì)胞增殖的活性，指明細(xì)胞增殖與糖尿病足動(dòng)脈病變的關(guān)系。在糖尿病足的不同辨證分型中動(dòng)脈的硬化閉塞程度由輕到重依次是脈絡(luò)熱毒證、氣陰兩虛瘀阻證、脈絡(luò)瘀熱證、氣血兩虛瘀阻證。Ki67的陽(yáng)性表達(dá)與糖尿病足動(dòng)脈硬化閉塞程度呈負(fù)相關(guān)。而在通過(guò)對(duì)32例糖尿病足截肢的動(dòng)脈進(jìn)行病理學(xué)觀察的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)糖尿病足血管病變主要體現(xiàn)在中動(dòng)脈的病理學(xué)變化，其中脈絡(luò)熱毒、氣陰兩虛瘀阻兩證型以動(dòng)脈周圍及全層的炎癥性改變?yōu)橹鳎幻}絡(luò)瘀熱、氣血兩虛瘀阻證以中膜鈣化、平滑肌細(xì)胞萎縮、變性、壞死及膠原纖維增多及內(nèi)膜粥樣斑塊形成為主，炎癥表現(xiàn)不明顯；而Ki67的陽(yáng)性指數(shù)與血管炎癥病變程度呈正相關(guān)。這說(shuō)明炎癥在糖尿病的大血管病變的過(guò)程中起了重要的作用，特別是在脈絡(luò)熱毒證、氣陰兩虛瘀阻證兩型，這對(duì)臨床具有重要的指導(dǎo)意義。

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第4篇：細(xì)胞增殖論文范文

關(guān)鍵詞：醇提物、細(xì)胞毒、MKN-28、SMMC-7721

中圖分類號(hào)：R9694文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-2349（2013）02-0048-02

惡性腫瘤嚴(yán)重的威脅著人類生命和健康，其發(fā)病率和死亡率在世界許多國(guó)家和地區(qū)居首位。據(jù)WHO預(yù)測(cè)，到2020年全球腫瘤發(fā)病率將上升50%，癌癥病人將增加的近1500萬(wàn)，惡性腫瘤將成為21世紀(jì)危害人類健康的頭號(hào)殺手。目前已上市的抗腫瘤藥物缺乏細(xì)胞毒性特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，往往無(wú)選擇地殺傷正常細(xì)胞，特別是增生活躍的造血干細(xì)胞，正常細(xì)胞的損傷常導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，影響治療效果和患者依從性。而近年來(lái)，從天然藥物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物成為研究熱點(diǎn)[1]。

景洪哥納香系蕃荔枝科哥納香屬植物，全世界約50種，分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)[2]。我國(guó)產(chǎn)10種，分布于西南、華南、臺(tái)灣等省區(qū)。在民間主要用于清熱、殺蟲(chóng)、抗癌、抗瘧等[3]。筆者通過(guò)體外觀察景洪哥納香醇提物對(duì)兩株人腫瘤細(xì)胞株的抗增殖作用，初步判斷其抗腫瘤活性。為將景洪哥納香抗腫瘤活性的進(jìn)一步研究提供必要的前期基礎(chǔ)。

1材料與方法

11材料人胃癌細(xì)胞MKN-28、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RMPI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自于GIBCO公司；新生牛血清購(gòu)自于杭州四季青試劑公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自于Sigma公司；三聯(lián)液（10mL SDS，5mL異丁醇，012mL HCL，定容至100mL）由實(shí)驗(yàn)室自己配置。注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素購(gòu)自于大連美羅大藥廠。

12細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)液含10%新生牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L鏈霉素，在37 ℃、5 %的二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，25 g/L胰酶+02 g/L EDTA消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

13體外抗增殖作用采用改良MTT法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以4×104/mL、90 μL /孔接種于96孔板中，分別加入陰性對(duì)照組生理鹽水（NS）、陽(yáng)性對(duì)照組（終濃度為01、1、10 μg/mL的順鉑）及終濃度分別為1、3、10、30、100 μg/mL的各種景洪哥納香醇提物，每個(gè)濃度均設(shè)4個(gè)平行孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 g/ L MTT 10 μL，振蕩混勻，4h后，每孔加入100 μL三聯(lián)液，12 h后，輕輕振蕩15 min，在酶標(biāo)儀上于490 nm/570 nm雙波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：

細(xì)胞抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%

并利用Gwbasic軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2結(jié)果

21形態(tài)學(xué)觀察不同濃度的景洪哥納香醇提物用于兩種人腫瘤細(xì)胞48h后，光學(xué)顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞增殖被顯著抑制（見(jiàn)圖1、圖2）。高濃度景洪哥納香醇提物與正常組比較，細(xì)胞貼壁能力下降，由不規(guī)則形狀逐漸變圓、皺縮、折光性降低，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片。且發(fā)現(xiàn)景洪哥納香醇提物對(duì)兩株人腫瘤細(xì)胞增殖抑制能力有一定的劑量依賴性。

22體外細(xì)胞增殖抑制作用改良MTT法觀察景洪哥納香醇提物對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，發(fā)現(xiàn)景洪哥納香醇提物在一定的劑量范圍內(nèi)，可以顯著的抑制MKN-28細(xì)胞的增殖能力，且具有顯著的劑量依賴性，其IC50為3102μg/mL。而其對(duì)SMMC-7721同樣具有顯著的細(xì)胞毒作用，但是劑量依賴性不明顯，其IC50為1888μg/mL。觀察發(fā)現(xiàn)，100μg/mL景洪哥納香醇提物對(duì)這兩株人腫瘤細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)95%以上。隨著濃度的降低，其細(xì)胞毒作用也逐漸降低。（見(jiàn)圖3）

3討論

中醫(yī)藥在治療癌癥方面有其獨(dú)到之處。近年來(lái)，從中藥中篩選抗癌活性成分以及抗癌先導(dǎo)化合物已成為這一領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，來(lái)源于植物藥的抗癌制劑，占總抗癌藥的1/3左右[4]。紫杉醇、喜樹(shù)堿、長(zhǎng)春新堿等已作為許多腫瘤的首選藥。我國(guó)的藥用植物種質(zhì)資源豐富，如果能將中藥中抗腫瘤有效成分分離出來(lái)，明確其抗腫瘤作用及機(jī)理，對(duì)于抗腫瘤藥物的研制開(kāi)發(fā)以及腫瘤治療具有非常重要的意義。[JP]

番荔枝科屬植物抗腫瘤活性顯著，在上世紀(jì)90年代就被多位國(guó)內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注[5]。景洪哥納香是番荔枝科哥納香屬植物，其抗腫瘤活性近年也開(kāi)始引起學(xué)者的關(guān)注[6]。筆者對(duì)景洪哥納香的醇提物在體外進(jìn)行了初步細(xì)胞毒活性測(cè)試，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)景洪哥納香醇提物高濃度時(shí)可以顯著抑制細(xì)胞增殖，且發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞碎片，提示筆者其抗MKN-28增殖作用的機(jī)制可能是直接殺死細(xì)胞，而不僅僅是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。改良MTT法研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤活性顯著，且具有一定的劑量依賴性。提示筆者可以進(jìn)一步觀察其對(duì)其它人腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞毒作用如何、以及其細(xì)胞毒活性是否存在時(shí)間依賴性及其抗腫瘤機(jī)制。

筆者通過(guò)體外觀察兩株人腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)景洪哥納香醇提物抗腫瘤活性進(jìn)行初探，以期為景洪哥納香的抗腫瘤活性研究提供必要的前期基礎(chǔ)。[KH*1D]

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第5篇：細(xì)胞增殖論文范文

【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)干細(xì)胞

［摘要］回顧國(guó)內(nèi)外有關(guān)阿爾茨海默病（Alzheimer disease， AD）與神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell， NSC）關(guān)系的文獻(xiàn)，結(jié)合針刺治療AD的實(shí)驗(yàn)研究成果，提出針刺原位誘導(dǎo)AD海馬內(nèi)源性NSC的增殖分化，可能是針刺治療AD的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究針刺治療AD提供了新的思路和方向。

［關(guān)鍵詞］阿爾茨海默病; 神經(jīng)干細(xì)胞; 針刺療法

Pondering insitu induction of endogenous neural stem cells in hippocampus of rats with Alzheimer disease by acupuncture

ABSTRACT Analysis of domestic and overseas literature on the relationship between Alzheimer disease (AD) and neural stem cells (NSC) shows that inducing the proliferation and differentiation of hippocampal endogenous NSC insitu by acupuncture is probably the mechanism of acupuncture therapy in treating AD， and that it may further improve the method for the research on AD.

KEY WORDS Alzheimer disease; neural stem cell; acupuncture therapy

阿爾茨海默病（Alzheimer disease， AD）是一種神經(jīng)退行性疾病。其特征性病理變化為：淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、基底前腦和海馬區(qū)的神經(jīng)元數(shù)目減少，并以海馬區(qū)受累最為嚴(yán)重，神經(jīng)元平均減少達(dá)47%［1］。目前全世界有2 000～2 500萬(wàn)AD患者，2050年將超過(guò)3 000萬(wàn)［2］，我國(guó)的AD患者已超過(guò)500萬(wàn)。有專家估計(jì)，我國(guó)用于治療AD患者的費(fèi)用，每年至少需50億，到2050年，預(yù)期費(fèi)用將超過(guò)10 000億［2］。因此，防治AD已成為全社會(huì)高度關(guān)注的問(wèn)題。

1AD的神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)策略

有研究認(rèn)為，神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell， NSC）將為AD的治療帶來(lái)革命性的前景［3～6］。早在2001年，在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院向美國(guó)國(guó)會(huì)呈遞的干細(xì)胞科學(xué)研究總結(jié)性報(bào)告中就指出：神經(jīng)系統(tǒng)疾病的干細(xì)胞研究是極少的有證據(jù)顯示能用細(xì)胞替換療法修復(fù)神經(jīng)喪失功能的研究領(lǐng)域之一［7］。NSC的修復(fù)方法主要有兩種。一是在實(shí)驗(yàn)室里，將未分化的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)為適合移植到患者體內(nèi)的已分化細(xì)胞。方法是在種植前就把這些細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使其向所需的已分化神經(jīng)細(xì)胞的方向分化，或者直接把它們種植到體內(nèi)，由體內(nèi)的信號(hào)來(lái)引導(dǎo)它們分化成熟為合適的腦細(xì)胞，即外源性移植。但這種方法主要存在免疫排斥、倫理道德以及胚胎來(lái)源有限等問(wèn)題。另一種修復(fù)方法是依靠生長(zhǎng)激素和其他營(yíng)養(yǎng)因子（生長(zhǎng)因子、激素）以及其他可以幫助細(xì)胞存活并生長(zhǎng)的信號(hào)分子，通過(guò)激活患者自己的干細(xì)胞和體內(nèi)的修復(fù)機(jī)制來(lái)修復(fù)由疾病或損傷引起的損害，也即內(nèi)源性原位誘導(dǎo)。這一修復(fù)方法已經(jīng)成為AD等神經(jīng)變性疾病NSC研究的熱點(diǎn)［8～10］，它不僅可成為補(bǔ)償或替代丟失的海馬神經(jīng)元的新策略，還可以完全避免外源性NSC移植所帶來(lái)的一系列問(wèn)題。

2AD的神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)研究思路

研究發(fā)現(xiàn)，AD病變自身存在內(nèi)源性NSC的增殖活化。在正常成年個(gè)體，內(nèi)源性NSC主要存在于環(huán)繞側(cè)腦室的大腦室下帶、紋狀體、海馬等部位。正常情況下它們處于靜止?fàn)顟B(tài)，在疾病或某些生長(zhǎng)因子的刺激下能被誘導(dǎo)、活化，以替代疾病中缺乏的神經(jīng)細(xì)胞［11～13］。在國(guó)外，Jin 等［14，15］研究了AD病變與NSC增殖活化之間的關(guān)系。他們以AD患者腦組織作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在AD患者的海馬組織中，與NSC增殖分化相關(guān)的蛋白標(biāo)志物doublecortin、多唾液酸神經(jīng)元黏附分子、TUC4（TOAD/Ulip/CRMP）和微管相關(guān)蛋白（microtubule associated protein， MAP）均呈現(xiàn)高表達(dá)；接著他們以轉(zhuǎn)基因小鼠AD模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在靜息NSC集中的兩個(gè)區(qū)域，即環(huán)繞側(cè)腦室的大腦室下帶和海馬齒狀回顆粒下層均有NSC的增殖活化。在國(guó)內(nèi)，金國(guó)華等［16～18］以切斷穹隆海馬傘作為AD模型，研究結(jié)果表明：穹隆海馬傘切斷后第7天時(shí)，MAP陽(yáng)性神經(jīng)元較多，胞體大、突起長(zhǎng)，第14天時(shí)細(xì)胞進(jìn)一步遷移、成熟；正常組第7天時(shí)僅見(jiàn)少量突起短的MAP陽(yáng)性神經(jīng)元，第14天時(shí)細(xì)胞稍增多，突起稍增長(zhǎng)；對(duì)照組第7天時(shí)未見(jiàn)MAP陽(yáng)性神經(jīng)元，第14天時(shí)僅有少量胞體小、突起短的MAP陽(yáng)性神經(jīng)元；而且，穹隆海馬傘切割側(cè)的海馬提取液可明顯促進(jìn)NSC分化為神經(jīng)元和膽堿能陽(yáng)性神經(jīng)元。這些研究表明：AD病變自身可作為一種刺激原，誘導(dǎo)內(nèi)源性NSC增殖活化。但AD病變后內(nèi)源性NSC的增殖活化對(duì)AD病變是有利還是有害呢？研究發(fā)現(xiàn)，給予NSC增殖活化的特異性抑制劑甲基氧化偶氮甲醇（methylazoxymethanol， MAM）后，不僅NSC的增殖活化受到抑制，同時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力亦下降［19，20］。提示：AD病變后內(nèi)源性NSC的增殖活化是機(jī)體實(shí)現(xiàn)自身修復(fù)的一種潛力。但是為什么AD仍呈進(jìn)行性發(fā)展呢？有研究認(rèn)為，除了與增殖分化的速度慢于凋亡的速度有關(guān)外，還與機(jī)體存在抑制NSC增殖分化的因素有關(guān)［14，15］。

加強(qiáng)促進(jìn)NSC增殖分化的因素或解除抑制NSC增殖分化的因素，都將有利于AD患者海馬內(nèi)源性NSC的增殖分化，實(shí)現(xiàn)AD的治療效應(yīng)。周思朗等［21］從增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類物質(zhì)以促進(jìn)原位誘導(dǎo)內(nèi)源性NSC增殖分化的角度，采用前腦Meynert基底核注射紅藻氨酸形成的AD模型，每天予以側(cè)腦室注射堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），7 d后發(fā)現(xiàn)，室管膜下區(qū)及海馬齒狀回代表NSC的溴脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine， BrdU）陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，提示bFGF可促進(jìn)AD模型大鼠腦內(nèi)NSC的增殖分化；同時(shí)，AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力亦有所改善。此外，對(duì)表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor， EGF）［22］、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子［23，24］、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子［25］和胰島素樣生長(zhǎng)因子1［26］等的研究也獲得了類似的結(jié)果。一些學(xué)者則從抑制NSC增殖分化因素的角度進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：海馬齒狀回內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生蛋白及其受體的高水平表達(dá)，是抑制海馬NSC增殖分化的關(guān)鍵因素［27～29］。抑制內(nèi)源性noggin蛋白的表達(dá)，可使NSC增殖分化降低，同時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力下降［30］；給予側(cè)腦室注射外源性noggin蛋白，可拮抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白4，促進(jìn)NSC增殖分化，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力［31，32］。此外，給予EGF和FGF或兩種以上物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合注射，亦可獲得類似的結(jié)果［33］。雖然動(dòng)物腦內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)已取得了很好的療效，但要在臨床推廣應(yīng)用仍存在難以長(zhǎng)期堅(jiān)持的問(wèn)題。聯(lián)合注射的療效可能更好，但究竟如何進(jìn)行聯(lián)合，目前尚無(wú)明確的答案。

3神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)研究的針刺介入

臨床研究［34~36］表明：針刺治療AD主要在于改善認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶的能力。在其作用機(jī)制的研究方面，已經(jīng)進(jìn)行了針刺治療AD的行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)（乙酰膽堿、興奮性氨基酸等）、血漿一氧化氮、細(xì)胞因子、血清β淀粉樣蛋白、生長(zhǎng)因子、突觸可塑性和信號(hào)傳導(dǎo)［37～45］等多方面的研究，但尚無(wú)應(yīng)用針刺原位誘導(dǎo)內(nèi)源性NSC進(jìn)行AD治療的作用機(jī)制研究的相關(guān)報(bào)道。但針刺原位誘導(dǎo)AD海馬內(nèi)源性NSC具有其自身的優(yōu)勢(shì)和極大的可行性。在自身優(yōu)勢(shì)方面，針刺療法的作用原理不是從外部向機(jī)體增加物質(zhì)，而是充分調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的內(nèi)在潛力，發(fā)揮治療和調(diào)整效應(yīng)，這樣可以避免NSC外源性移植或注射誘導(dǎo)所帶來(lái)的倫理道德、免疫排斥以及難于長(zhǎng)期堅(jiān)持等問(wèn)題。其次，有研究發(fā)現(xiàn)［46］，外源性給予兩種或兩種以上的某些物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)，效應(yīng)會(huì)是1＋1＞2，但哪些物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)效應(yīng)最佳，尚未有明確的結(jié)論。目前公認(rèn)，針刺療法具有綜合性、整體性、雙向性等自身調(diào)整的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，可以從多環(huán)節(jié)、多途徑進(jìn)行調(diào)整。它既可能增強(qiáng)NSC增殖活化的因素，也可能解除抑制NSC增殖活化的因素，從而發(fā)揮最大的誘導(dǎo)效應(yīng)。針刺原位誘導(dǎo)除了有自身的優(yōu)勢(shì)外，還有極大的可行性。首先是間接依據(jù)方面，目前針刺對(duì)脊髓損傷、腦梗死和帕金森病后NSC作用的研究已取得部分成果。Cui等［47］制作大鼠脊髓損傷模型后，行督脈電針，1次/d，電針7 d后，檢測(cè)NSC增殖和分化標(biāo)記物nestin的表達(dá)。結(jié)果顯示：在督脈電針后第7、14、21和28天，nestin的表達(dá)均增加，且增加的nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與神經(jīng)功能改善相平行。李常新等［48］研究表明：電針可通過(guò)干預(yù)腦內(nèi)內(nèi)源性NSC的變化促進(jìn)腦梗死的恢復(fù)。電針治療不僅可促進(jìn)室管膜下層、病灶周圍及海馬NSC的增生，促進(jìn)急性期新生神經(jīng)元的增多，還可使病灶周圍、遷移流動(dòng)帶處及海馬移行細(xì)胞及移行的NSC增多，增加移行的新生神經(jīng)元。我們?cè)谝淹瓿傻摹半娽槍?duì)帕金森小鼠NSC多巴胺神經(jīng)元突觸形態(tài)與功能可塑性影響的研究”中發(fā)現(xiàn)，針刺可誘導(dǎo)黑質(zhì)致密部?jī)?nèi)源性腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子［49］和NSC標(biāo)記物nestin的表達(dá)，促進(jìn)NSC的增殖、分化，從而促進(jìn)突觸可塑性的發(fā)揮。這些研究結(jié)果為針刺原位誘導(dǎo)AD海馬NSC的可能性提供了間接的依據(jù)。在直接依據(jù)方面，我們?cè)谝呀Y(jié)題的“電針促進(jìn)老年癡呆大鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響及機(jī)制”的研究中發(fā)現(xiàn)，電針可以誘導(dǎo)老年癡呆大鼠海馬內(nèi)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、一氧化氮和cfos的表達(dá)，從而增強(qiáng)海馬殘存神經(jīng)元形態(tài)的可塑性，發(fā)揮其代償功能［43］；同時(shí)，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬膽堿能神經(jīng)元陽(yáng)性數(shù)目增多，乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)。結(jié)合Calza 等［50］的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以誘導(dǎo)海馬NSC定向分化為膽堿能神經(jīng)元，我們認(rèn)為：針刺療法極有可能是通過(guò)增強(qiáng)海馬內(nèi)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)了海馬內(nèi)源性NSC的增殖活化，并定向分化形成新生的膽堿能神經(jīng)元。如果能作進(jìn)一步的深入研究，將會(huì)為針刺治療AD作用機(jī)制的研究提供新的思路和方向。

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第6篇：細(xì)胞增殖論文范文

論文關(guān)鍵詞：基因治療,移植靜脈,再狹窄

隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，像靜脈移植等手術(shù)方法治療包括冠狀動(dòng)脈在內(nèi)的血管狹窄等疾病給病人生活帶來(lái)新的希望，但術(shù)后通暢率逐年下降又給病人帶來(lái)新的憂慮。目前對(duì)預(yù)防移植靜脈再狹窄主要手段有放射、藥物、物理治療，雖然有一定成效，但效果還是不佳，隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們將希望寄托于基因治療。下面將對(duì)基因治療中目的基因和載體的選擇進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1.目的基因的種類靜脈橋再狹窄主要機(jī)制就是內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；血栓形成；平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖。這為我們目的基因的選擇提供依據(jù)。

1.1促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)的基因。

1.1.1內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)一氧化氮（NO）是體內(nèi)重要的生物信使分子和效應(yīng)分子，它具有抑制vsmc增殖、遷移，抑制血小板聚集等功能。而eNOS是NO合成的關(guān)鍵酶，通過(guò)將eNOS基因局部轉(zhuǎn)移，是防止移植血管狹窄的有效手段。王曉明等通過(guò)給靜脈橋轉(zhuǎn)染帶有eNOS基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，再旁路移植到動(dòng)脈后得出其加速內(nèi)皮細(xì)胞再生、抑制血栓形成，進(jìn)而抑制內(nèi)膜增生。

1.1.2血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)VEGF能高效的刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，使損傷的內(nèi)皮盡快得到修復(fù)，也可以間接抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖。VEGF165是最主要的異構(gòu)體，是其生物學(xué)作用的主要形式，也是目前的基因治療中主要選用的異構(gòu)體。有研究表明通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的VEGF過(guò)度表達(dá)可以使球囊損傷的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞再生，抑制血管內(nèi)膜增殖。

1.1.3肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF):HGF是一種間質(zhì)細(xì)胞衍生的多功能細(xì)胞因子，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂和增殖,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的修復(fù)，但不引起VSMC的增殖。有研究表明轉(zhuǎn)染HGF基因可增強(qiáng)球囊損傷后血管內(nèi)皮組細(xì)胞的功能，有效抑制損傷血管的狹窄。

1.2抗血栓形成的基因。

1.2.1組織因子途徑抑制物(TFPI)TFPI是相對(duì)穩(wěn)定的糖蛋白，是廣譜的Kunitz類型絲氨酸蛋白酶抑制物，其具有很強(qiáng)的抗凝作用。有研究表明通過(guò)腺病毒介導(dǎo)TFPI基因局部轉(zhuǎn)染可以顯著抑制PICA術(shù)后血栓形成和內(nèi)膜增厚，主要是通過(guò)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）凋亡而抑制血管的狹窄的。

1.2.2組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)t-PA纖溶酶原激活劑主要物質(zhì)之一，主要有血管內(nèi)皮細(xì)胞合成。其主要功能就是裂解纖溶酶原肽鍵，形成具有活性的纖溶酶。Ross報(bào)道t-PA減少能使經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PTcA)后血管狹窄,可見(jiàn)t-PA在預(yù)防血管狹窄中起到比較重要的作用。t-PA不僅能預(yù)防血管狹窄，有項(xiàng)研究也表明tPA基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體直接注入介入手術(shù)后再狹窄動(dòng)物模型的血管壁可以減輕狹窄面積，甚至能達(dá)到30%。

1.3抑制VSMC增殖遷移的基因。

自體移植靜脈再狹窄的主要病理特征為內(nèi)膜顯著增厚。增厚內(nèi)膜主要是由血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移等因素形成，其中有很多調(diào)節(jié)步驟參與當(dāng)中。這為我們抑制VSMC增殖、遷移提供許多候選基因。單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）是一種能使無(wú)活性的核昔類似物輕甲基無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷轉(zhuǎn)化為磷酸化的細(xì)胞毒性形式，誘導(dǎo)DNA鏈合成中止引起細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)研究表明HSV-tk基因能抑制新生內(nèi)膜形成、降低內(nèi)膜面積與中膜面積的比值(I：M)。FAS是一種凋亡受體，在VSMC中表達(dá)較多，當(dāng)FAS配體在血管壁上表達(dá)也可以降低新生內(nèi)膜的形成。抗細(xì)胞遷移金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)基因在VSMC的遷移中有十分重要的作用,組織型金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)及其同家族成員都有顯著減低I:M比例.

1.4聯(lián)合基因治療

由于預(yù)防移植靜脈狹窄干預(yù)靶點(diǎn)太多,而誰(shuí)是關(guān)鍵基因尚未確定,又加上單一靶點(diǎn)效果并不理想,于是有人聯(lián)合多個(gè)基因進(jìn)行干預(yù),證明比單一基因干預(yù)更有效。Gunn等用C-myb的反義核酸得出能抑制豬經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后的內(nèi)膜增生.VanBelle等在兔股動(dòng)脈上給予VEGF165質(zhì)粒可以加速內(nèi)皮化,減少附壁血栓和新生內(nèi)膜形成。張鐵民等實(shí)驗(yàn)顯示,反義寡核苷酸與VEGF聯(lián)合應(yīng)用較兩者單用更能顯著預(yù)防再狹窄。

2.載體的種類為了獲得一個(gè)好的臨床治療效果，載體的選擇是重要的一步。載體就是將目的基因?qū)胩厥獠课坏墓ぞ撸ǔ７譃椴《据d體和非病毒載體，它們各有自己的優(yōu)缺點(diǎn)。

2.1病毒載體的種類

2.1.1腺病毒載體腺病毒是無(wú)包膜的線性雙鏈DNA病毒，目前的腺病毒載體大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）為基礎(chǔ)。腺病毒主要優(yōu)點(diǎn)有轉(zhuǎn)染細(xì)胞廣泛、攜帶的DNA量大、感染效率高、重組病毒滴度高、不整合到宿主細(xì)胞、理化性質(zhì)穩(wěn)定等。以腺病毒介導(dǎo)的基因治療預(yù)防血管狹窄的研究層出不窮。體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間短暫、病毒基因表達(dá)的產(chǎn)物引起的毒性反應(yīng)限制腺病毒這個(gè)載體的應(yīng)用。正因如此，對(duì)腺病毒載體的改進(jìn)正在進(jìn)行，如經(jīng)RGD-4C整合素靶向多肽改良后的腺病毒在靜脈橋中有更好的轉(zhuǎn)染能力

2.1.2腺相關(guān)病毒載體（rAAV）rAAV源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣、免疫源性低，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一。

通用的AAV載體都是基于血清型2，即AAV2。因?yàn)閞AAV感染效率低、制備成本高且只能包裝小于4.7kb的基因序列而在基因治療中受到限制。

2.1.3慢病毒載體慢病毒載體（LVs）是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效的將目的基因?qū)雱?dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。LVs具有免疫原性低、整合到細(xì)胞上長(zhǎng)期表達(dá)、可感染非分裂期與分裂期細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn).已有研究表明慢病毒載體應(yīng)用于球囊損傷致血管狹窄研究的可行性。但慢病毒仍具有潛在的產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒（RCL）和致癌的風(fēng)險(xiǎn)，相關(guān)的研究還是有待加強(qiáng)。

2.2非病毒載體非病毒載體是通過(guò)哺乳細(xì)胞攝取和細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)大分子物質(zhì)的機(jī)制來(lái)把目的基因轉(zhuǎn)入靶器官。雖然非病毒載體具有安全、易得、無(wú)免疫源性等優(yōu)點(diǎn)，但是他們基本上轉(zhuǎn)染效率不高，因此早期在基因治療研究中沒(méi)有太高的地位。隨著技術(shù)的進(jìn)步，非病毒載體在基因治療載體選擇上占有一定份額，尤其表現(xiàn)在納米粒子、超聲微泡載體上。

2.2.1超聲微泡載體：它的作用原理是通過(guò)超聲的物理效應(yīng)使細(xì)胞膜上產(chǎn)生可逆的小孔，借助此孔外源性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Taniyama等通過(guò)超聲微泡載體將p53的cDNA轉(zhuǎn)入球囊損傷大鼠頸動(dòng)脈，得出血管內(nèi)膜和中膜面積的比值顯著降低。雖然超聲微泡靶向釋放技術(shù)的靶向性及無(wú)創(chuàng)性的優(yōu)點(diǎn)已達(dá)到大部分實(shí)驗(yàn)的認(rèn)可，但其轉(zhuǎn)染效率不高仍是需要大力研究的。

2.2.2納米粒子：它是現(xiàn)在研究比較熱門一種非病毒載體，主要是可以使被包裹的目的基因免受水解酶的降解，將目的基因運(yùn)載到血管平滑肌上，達(dá)到治療疾病的目的。胡新華等通過(guò)納米粒子介導(dǎo)的反義雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因抑制移植靜脈內(nèi)膜增生得出納米粒子在血管狹窄治療中是可行的。現(xiàn)在用的納米粒子主要是PLGA，它有很好的組織相容性，產(chǎn)物沒(méi)有任何毒性。

3.總結(jié)和展望

這些年來(lái)盡管科研及醫(yī)務(wù)工作者在移植靜脈獲取技術(shù)、藥物防治、應(yīng)用血管外支架和放射治療等方面做了大量的工作并在預(yù)防移植靜脈再狹窄上取得一定成效，但是總體效果還是不理想。移植后的靜脈因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、平滑肌細(xì)胞遷移增殖、細(xì)胞外基質(zhì)增加等一系列病理改變導(dǎo)致移植靜脈再狹窄。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，安全、高效的載體出現(xiàn)、多基因聯(lián)合等綜合治療必將能有效預(yù)防血管再狹窄。

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第7篇：細(xì)胞增殖論文范文

1 材料和方法

1.1 試劑

ACC高轉(zhuǎn)移株ACCM、低轉(zhuǎn)移株ACC2由四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。Trizol試劑盒（Life Technologies公司，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒（TaKaRa公司，日本），MMP9抗體、山羊抗兔二抗、辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物及顯色劑DAB抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體（Bioworld Technology公司，美國(guó)），磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體（phospho-rylation epidermal growth factor receptor，P-EGFR）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phosphorylation extra-cellular signal-regulated kinase，P-ERK）、KGF抗體（Abcam公司，美國(guó)）。過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物（Millipore公司，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

ACC細(xì)胞培養(yǎng)：在RPMI 1640、10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 μg·mL-1鏈霉素培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，細(xì)胞傳代采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ACC2接種于培養(yǎng)面積為25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，設(shè)定壓力強(qiáng)度為103.74 kPa，根據(jù)加壓時(shí)間不同將實(shí)驗(yàn)組分為3 h組、6 h組、12 h組、24 h組。另外將加壓培養(yǎng)的ACC2設(shè)置為陰性對(duì)照組，未加壓培養(yǎng)的ACCM設(shè)置為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.4 免疫組織化學(xué)法半定量檢測(cè)EGFR的表達(dá)

將密度為5×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液滴于爬片中央，待細(xì)胞貼壁后，在孔板內(nèi)追加培養(yǎng)基，孵育過(guò)夜，于103.74 kPa加壓3、6、12、24 h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min。所有的細(xì)胞爬片均按免疫ABC法進(jìn)行檢測(cè)。3%過(guò)氧化氫液37 ℃孵育20 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；羊血清37 ℃封閉30 min；滴加EGFR抗體4 ℃過(guò)夜，次日37 ℃復(fù)溫1 h；二抗37 ℃孵育30 min；辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物37 ℃ 30 min，DAB顯示1 min。設(shè)立空白對(duì)照：兔血清代替一抗；陰性對(duì)照：PBS代替一抗。顯微鏡下細(xì)胞膜及細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒即為EGFR表達(dá)陽(yáng)性。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase poly-merase chain reaction，RT-PCR）法檢測(cè)MMP9和EGFR mRNA的表達(dá)取各組細(xì)胞，以Trizol試劑盒方法提取總RNA，取等量RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，經(jīng)Taq-DNA聚合酶作用擴(kuò)增目標(biāo)基因MMP9、EGFR、GAPDH。以GAPDH為內(nèi)參，分析MMP9和EGFR基因的mRNA水平。以未加壓組基因的表達(dá)量為基線，分析各處理組表達(dá)量的改變。MMP9引物序列：5’TCCAGTAGACAATCCTTGCAATGTG3’（正義鏈），5’CTC-CGTGATTCGAGAACTTCCAATA3’（反義鏈）；EGFR引物序列：5’GAGTAACAAGCTCACGCAG-TTG3’（正義鏈），5’GAGGAC ATAACCAGCCA-CCTC3’（反義鏈）；GAPDH引物序列：5’CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC3’（正義鏈），5’GTA-GAGGCAGGGATGATGTTCT3’（反義鏈）。

1.6 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，以PBS清洗，加入細(xì)胞裂解混合液后，將細(xì)胞刮下，14 000 r·min-1離心15 min，取上清并[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]行蛋白含量測(cè)定。加入等體積5×SDS-PAGE上樣緩沖液，置沸水浴中加熱10 min。樣本在10% SDS-PAGE凝膠中電泳，電壓100 V。電泳完成后濕轉(zhuǎn)或半干PVDF膜上，再將此膜于4 ℃封閉過(guò)夜。次日按Western blot試劑盒說(shuō)明書，利用抗人MMP9、EGFR、P-EGFR、KGF、P-ERK單抗進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 加壓環(huán)境對(duì)細(xì)胞內(nèi)EGFR表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明：陰性對(duì)照組ACC2低表達(dá)EGFR，隨著加壓時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組EGFR表達(dá)逐漸增加，整體呈時(shí)間正相關(guān)性，加壓12 h后達(dá)到最大，與陽(yáng)性對(duì)照組ACCM的表達(dá)接近（圖1）。

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明：1）與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組EGFR的表達(dá)量在加壓3 h后達(dá)到峰值，超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照組中EGFR蛋白表達(dá)量，但是其蛋白表達(dá)量并未隨著加壓時(shí)間延長(zhǎng)而逐步增加，在加壓24 h后降至與陰性對(duì)照組相似水平。盡管EGFR的表達(dá)量未體現(xiàn)出明顯的時(shí)間相關(guān)性，但在加壓后，總蛋白的表達(dá)量仍有明顯的上調(diào)。2）實(shí)驗(yàn)組P-EGFR的表達(dá)量呈時(shí)間正相關(guān)性，隨著加壓時(shí)間的延長(zhǎng)，P-EGFR蛋白表達(dá)量逐漸增長(zhǎng)，并在加壓24 h后達(dá)到峰值，而陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組中P-EGFR均為低表達(dá)（圖2）。

2.2 加壓環(huán)境對(duì)MMP9和EGFR mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果表明：MMP-9和EGFR mRNA的表達(dá)量在加壓6 h開(kāi)始上 調(diào)，在加壓24 h達(dá)到最大，表達(dá)量整體表現(xiàn)出時(shí)間正相關(guān)性。MMP-9加壓24 h后其表達(dá)量是陰性對(duì)照組的3.8倍，EGFR加壓24 h其表達(dá)量是陰性對(duì)照組的4.5倍（圖3）。

2.3 壓力刺激對(duì)轉(zhuǎn)移黏附相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組隨著加壓時(shí)間的延長(zhǎng)，MMP9、KGF、P-ERK蛋白的表達(dá)量均逐漸增加。MMP9及P-ERK的表達(dá)量在加壓6 h后明顯增加，加壓24 h后略有降低；KGF的表達(dá)量與時(shí)間呈正相關(guān)，蛋白表達(dá)量在加壓24 h后達(dá)到最大。陰性對(duì)照組的MMP9、KGF、P-ERK均低表達(dá)。

3 討論

為了驗(yàn)證腫瘤微環(huán)境能與各種基因相互作用，本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)半定量檢測(cè)不同加壓時(shí)間對(duì)EGFR表達(dá)的影響，結(jié)果顯示ACC2細(xì)胞在間質(zhì)液壓升高的情況下上調(diào)EGFR表達(dá)量。為了更準(zhǔn)確地證明間質(zhì)液壓的升高可以影響EGFR蛋白水平的表達(dá)，本研究還采用Western blot方法檢測(cè)了EGFR及P-EGFR的表達(dá)情況，結(jié)果也證實(shí)了腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)液壓與ACC2中蛋白表達(dá)改變的相關(guān)性。

MMP9與細(xì)胞侵襲遷移能力相關(guān)，且ACC細(xì)胞的侵襲性與加壓時(shí)間呈正相關(guān)性[7]。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了MMP9的mRNA及蛋白表達(dá)量，RT-PCR結(jié)果顯示IFP的升高可從mRNA水平上調(diào)MMP9基因的表達(dá)，從而改變細(xì)胞的生物學(xué)行為，進(jìn)一步證實(shí)了腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用；然而蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果卻是在加壓環(huán)境中MMP9的蛋白表達(dá)量并未隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐步增加，僅在加壓6 h及12 h后出現(xiàn)了表達(dá)高峰。筆者推測(cè)，在ACC中可能還存在其他的與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子。研究認(rèn)為：P-ERK的上調(diào)與ACC肺轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]，KGF是與腺樣囊性癌密切相關(guān)的黏附相關(guān)分子，加之腫瘤微環(huán)境中IFP的升高也為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供了有利環(huán)境[4，8-9]。在本實(shí)驗(yàn)中筆者檢測(cè)了加壓環(huán)境中P-ERK及KGF在ACC中的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果在一定程度上證實(shí)了這兩種蛋白的表達(dá)量隨著加壓時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步增加。這就為加壓環(huán)境中腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移能力增加提供了分子基礎(chǔ)。同時(shí)蛋白水平的檢測(cè)也證實(shí)了EGFR及P-EGFR的表達(dá)量隨著環(huán)境的改變而改變。這一結(jié)果表明腫瘤微環(huán)境可與腫瘤細(xì)胞相互作用，改變細(xì)胞的生物學(xué)行為。隨著IFP的升高，細(xì)胞內(nèi)與惡性表型相關(guān)的基因及蛋白表達(dá)量增加，為ACC2侵襲轉(zhuǎn)移提供了分子基礎(chǔ)。

IFP的升高與調(diào)控血管生成的基因相關(guān)，降低其表達(dá)或者改善間質(zhì)流體動(dòng)力學(xué)可早期降低IFP，從而利于常規(guī)放化療的進(jìn)行[4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vas-cular endothelial growth factor，VEGF）、碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase Ⅸ，CAⅨ）、丙酮酸脫氫酶激酶1等基因產(chǎn)物可改變血管的滲透性，降低間質(zhì)液壓，改善細(xì)胞外酸化和缺氧，從而克服腫瘤微環(huán)境成為治療屏障這一問(wèn)題[10]。趨化因子受體CXCR4與腺樣囊性癌的組織學(xué)類型及轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)性。在高壓環(huán)境下黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）以及Src的激活有利于直腸癌細(xì)胞的黏附。那么IFP的升高會(huì)影響ACC細(xì)胞的黏附能力嗎？能否解釋ACC的極易復(fù)發(fā)、早期轉(zhuǎn)移以及神經(jīng)侵襲性的生物學(xué)行為呢？因此在今后的實(shí)驗(yàn)中，將繼續(xù)檢測(cè)與血管相關(guān)的分子（如血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子、VEGF-A、VEGF-C及組織纖維蛋白溶酶原激活劑以及Src等）在加壓環(huán)境中表達(dá)量是否改變，進(jìn)一步建立體內(nèi)模型；并且，利用VEGF抑制劑、CAⅨ以及丙酮酸脫氫酶激酶1的基因產(chǎn)物來(lái)改善腫瘤微環(huán)境中升高的間質(zhì)液壓，觀察ACC的生物學(xué)行為以及上述指標(biāo)的表達(dá)情況，為腫瘤治療提供理論依據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明，腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)液壓的升高可從mRNA及蛋白水平兩方面影響MMP9、KGF、P-ERK的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲能力。

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第8篇：細(xì)胞增殖論文范文

論文摘要：真菌多糖是一類重要的保健功能因子，具有明顯的生物活性作用。本文主要介紹了國(guó)內(nèi)外對(duì)真菌多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性等方面的研究進(jìn)展。

0前言

真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的，能夠控制細(xì)胞分裂分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)衰老的一類活性多糖[1][2]，大量研究證明，真菌多糖具有免疫增強(qiáng)與調(diào)節(jié)、抗病毒、抗放射、抗腫瘤、抗凝血、抗衰老等作用[3]，是公認(rèn)的安全低毒活性物質(zhì)，是近年來(lái)人們關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一，本文就真菌多糖研究的進(jìn)展進(jìn)行概括、總結(jié)，以期對(duì)多糖的研究開(kāi)發(fā)提供參考。

1真菌多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)[4][5]

真菌多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)。真菌多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)主鏈主要有兩種：一種是葡聚糖，以β-1，3糖苷鍵連接為主，兼有少量β-1，4或β-1，6糖苷鍵，如自然界中的茯苓多糖、云芝多糖等的分子結(jié)構(gòu)；另一種是甘露聚糖，主要由α-糖苷鍵連接，如：冬蟲(chóng)夏草多糖是α-1，2糖苷鍵連接，銀耳多糖和黑木耳多糖是α-1，3糖苷鍵連接。真菌多糖的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多糖骨架鏈間以氫鍵結(jié)合形成的各種聚合體，只與分子主鏈的構(gòu)象有關(guān)，不涉及側(cè)鏈的空間排布形式。真菌多糖的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指由多糖中糖殘基中的官能團(tuán)間通過(guò)非共價(jià)作用而導(dǎo)致的有序、規(guī)則而粗大的空間構(gòu)象。四級(jí)結(jié)構(gòu)是指多糖多聚鏈間以非共價(jià)作用力而結(jié)合形成的聚集體。

2真菌多糖的生物活性

2.1抗腫瘤作用真菌多糖對(duì)癌細(xì)胞并沒(méi)有直接殺傷能力，其有效作用就在于能增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬癌細(xì)胞的功能，激活來(lái)自胸腺淋巴的T細(xì)胞和來(lái)自骨髓淋巴的B細(xì)胞，促進(jìn)抗體的形成。如豬苓多糖對(duì)PHA活化的淋巴細(xì)胞具有明顯的促增殖作用,抑制S-180肉瘤細(xì)胞的增殖[6][7]。茯苓多糖在堿性條件下與氯乙酸反應(yīng)生成一種水溶性多糖，羧甲基茯苓多糖(Carboxymethyl-pachymaran，CMP)，CMP對(duì)小鼠腫瘤U-14、昆明種小鼠S-180肉瘤等有抑制作用[8]。曾報(bào)道從金針菇中提取幾種不同結(jié)構(gòu)和單糖組分的金針菇多糖，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)小鼠肉瘤S-180具有明顯的抑制作用，并認(rèn)為是通過(guò)恢復(fù)和提高免疫力方法來(lái)達(dá)到抑制腫瘤的目的[9]。

2.2降血糖作用香菇多糖有顯著的降血糖、改善糖耐量、增加體內(nèi)肝糖原的作用，其作用是通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝、促進(jìn)肝糖原合成、減少肝糖原分解引起的，對(duì)糖尿病大鼠的心肌、膈肌和腦組織具有保護(hù)作用[10][11]。王慧銘等[12]將Wister大鼠腹腔注射四氧嘧啶建立糖尿病動(dòng)物模型，并將其隨機(jī)分組灌胃。21天后觀察到香菇多糖有明顯的降血糖作用(P<0.05)。靈芝多糖也有明顯的降血糖作用，羅少洪[13]對(duì)此做了研究，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖在灌胃劑量達(dá)l00mg/kg以上時(shí)，可明顯降低高血糖小鼠血糖水平，無(wú)劑量效應(yīng)關(guān)系；對(duì)鏈脈霉素誘發(fā)的高血糖小鼠，在200mg/kg劑量時(shí)，可降低正常小鼠的血糖，有明顯的刺激胰島素分泌的作用，并可明顯增強(qiáng)高血糖小鼠對(duì)葡萄糖的耐受力，這與張玲芝等[14]的研究結(jié)論基本一致：靈芝多糖的主要降糖機(jī)制可能是通過(guò)靈芝多糖對(duì)胰島細(xì)胞的不同程度的修復(fù)而促進(jìn)胰島素分泌，進(jìn)而降低血糖的。[11］張昕，張強(qiáng)，梁彥龍.香菇多糖的抗腫瘤和降糖作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥事，2008，(22)2：149-154.

[12］王慧銘，項(xiàng)偉嵐，潘宏銘等.香菇多糖對(duì)高血糖大鼠降血糖作用及其機(jī)理的研究〔J〕.浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，29(5):68.

[13］羅少洪，楊紅.靈芝多糖調(diào)節(jié)血糖作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕，廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2000,16(2):119-120.

[14]張玲芝.靈芝多糖降血糖的機(jī)理探討[J].福建醫(yī)藥雜志，2004,26(3):137-140.

[15]姚金鳳吳亮等.靈芝多糖降血糖的機(jī)理探討[J].福建醫(yī)藥雜志，2004，26(3):137-140.

[16]張秀娟，季宇彬.真菌多糖的免疫藥理作用的研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002,18(1):63-65.

[17]陳金煙，盧政輝.真菌多糖的免疫效應(yīng)抗腫瘤作用機(jī)理的探討[J].福建輕紡，2002，4:4-7.

第9篇：細(xì)胞增殖論文范文

【關(guān)鍵詞】孕中期羊水;間充質(zhì)干細(xì)胞;臍血

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有多向分化潛能,是細(xì)胞治療及基因治療的理想種子細(xì)胞。已有研究顯示羊水[1]和臍血[2]可以分離出MSCs，那么這兩種來(lái)源的MSCs有哪些異同呢?為此本研究將對(duì)孕中期人的羊水及新生兒的臍血進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，并對(duì)其基本生物學(xué)特性進(jìn)行了比較研究，為組織工程選取種子細(xì)胞提供基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下論文。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源

羊水標(biāo)本取自2008年3月至2010年3月吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬465醫(yī)院婦產(chǎn)科，妊娠在15～22周的引產(chǎn)羊水35份;32份臍帶血標(biāo)本取自正常足月剖腹產(chǎn)或足月正常產(chǎn)乙肝病毒檢測(cè)陰性的孕婦。取標(biāo)本前均征得孕婦本人同意，研究獲得吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬465醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器

PRMI1640(GIBCOBRL)，胎牛血清(GIBCOBRL)，馬血清(GIBCOBRL)，1.077×103g/LFicoll淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠)，細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒(BASO公司)，CO2培養(yǎng)箱(FormaScientific公司)，熒光倒置顯微鏡(TE300,Nikon公司)。

1.3孕中期羊水MSCs的分離與培養(yǎng)羊水標(biāo)本在室溫下1500r/min離心5min，棄上清，加入含10%胎牛血清(FBS)的PRMI1640培養(yǎng)液，制成密度為(1～5)×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，接種到φ60mm塑料培養(yǎng)皿中，置飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天首次換液，去除非貼壁細(xì)胞，當(dāng)類成纖維樣細(xì)胞鋪滿平皿達(dá)80%時(shí)，用0.25%的胰酶消化，用PRMI1640培養(yǎng)液制成濃度為4×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種到新培養(yǎng)皿中，記為第1代(P1)。每3d用含10%FBS的PRMI1640培養(yǎng)液換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到90%融合時(shí)按1∶4的比例傳代。

1.4新生兒臍帶血MSCs的分離與培養(yǎng)無(wú)菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)或足月正常產(chǎn)乙肝病毒檢測(cè)陰性孕婦的臍帶血50～80mL，放于含CPDA1復(fù)合抗凝劑的采血袋中，所有樣本均在采集后12h內(nèi)進(jìn)行分離;將臍血用等量的DHank′s液稀釋制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞懸液沿管壁緩慢加入到相對(duì)密度為1.077×103g/LFicoll人淋巴細(xì)胞分離液上層,其比例為2∶1,注意液面清晰分層，以1500r/min進(jìn)行梯度離心20min，然后緩慢吸取中間交界面細(xì)胞懸液至另一離心管，獲得含人MSCs的單個(gè)核細(xì)胞懸液，加入含10%FBS的PRMI1640完全培養(yǎng)基,吹打并計(jì)數(shù)。以5×105個(gè)/mL的密度接種到φ60mm培養(yǎng)皿中，48h首次換液,以后每3d換液。換液用含10%FBS的PRMI1640完全培養(yǎng)基。在細(xì)胞80%左右融合時(shí),用0.25%胰酶室溫消化5min，適量小牛血清終止消化反應(yīng)，吸管輕輕吹打，轉(zhuǎn)入離心管中1500r/min離心10min，棄上清，按1∶3比例傳代。

1.5MSCs的生長(zhǎng)曲線測(cè)定將傳至3、5、8代的MSCs制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔0.5mL;每天取3孔，消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，共8d。以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6MSCs的代謝情況檢測(cè)傳3代的羊水MSCs按5×104/mL密度接種于φ35mm的培養(yǎng)皿中。2d后分別對(duì)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞進(jìn)行POX、SB、PAS、αNAE和ALP細(xì)胞化學(xué)染色，顯微鏡觀察、拍照。同樣，新生兒臍血源性MSCs取第3代以后細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色分析。

2結(jié)果

2.1羊水MSCs

從羊水中分離出的細(xì)胞,將之接種于PRMI1640培養(yǎng)基中,2～3d部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁,4～7d逐漸出現(xiàn)貼壁的MSCs,開(kāi)始為圓形,逐漸伸出突起,呈成纖維樣、梭形，最初散在分布,后逐漸在局部形成集落生長(zhǎng)(圖1)。一周以后MSCs迅速擴(kuò)增(圖2),約10d后可達(dá)80%～90%融合,擴(kuò)增變緩,即可傳代。傳代后羊水MSCs5～6h即可貼壁,2～4d生長(zhǎng)迅速,1周后即可再次傳代。形態(tài)為均一的成纖維樣的MSCs，呈漩渦樣生長(zhǎng),即為羊水源性的MSCs(圖3)。

2.2新生兒臍血MSCs

臍血的單個(gè)核細(xì)胞懸液接種于φ60mm的塑料培養(yǎng)皿中，原代培養(yǎng)6d后，在倒置顯微鏡下可見(jiàn)單個(gè)或少量呈集落生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞，形態(tài)大多為橢圓形或短梭形，凸出于培養(yǎng)皿表面。粘附于貼壁細(xì)胞之上的造血細(xì)胞和其他細(xì)胞在換液的過(guò)程中逐漸被清除，10d后就形成細(xì)小纖維狀小集落，20～25d后細(xì)胞集落不斷地?cái)U(kuò)大并形成融合超過(guò)80%，細(xì)胞形態(tài)大多呈短梭形。傳代培養(yǎng)后的臍血MSCs12h即可貼壁，4～14d生長(zhǎng)迅速,10d后即可再次傳代,細(xì)胞呈短梭形生長(zhǎng)(圖4，25×)。10代左右細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)開(kāi)始急劇衰退,細(xì)胞顆粒化嚴(yán)重，增殖速度嚴(yán)重放慢。

2.3MSCs的生長(zhǎng)曲線

人羊水源性MSCs生長(zhǎng)曲線呈“S”形，傳代后第1、2天為潛伏適應(yīng)期，從第3天開(kāi)始細(xì)胞增殖加速并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6至7天達(dá)到高峰，以后進(jìn)入平臺(tái)期。通過(guò)對(duì)第3、5、8代新生兒臍血源性的MSCs細(xì)胞計(jì)數(shù),繪制的生長(zhǎng)曲線形狀與羊水源性MSCs生長(zhǎng)曲線形狀相似，呈S形(圖5);傳代第1至3天為生長(zhǎng)停滯期，第4對(duì)14天為快速增殖期，后即進(jìn)入平臺(tái)期。隨傳代次數(shù)增加,MSCs的增殖能力有所減弱。第3、5代細(xì)胞增殖能力最強(qiáng),第8代細(xì)胞較第3、5代細(xì)胞增殖能力減弱較明顯，但亦呈“S”形。

2.4不同源性MSCs的生物化學(xué)特征

羊水源性MSCs及臍血源性MSCs具有相同的生物化學(xué)特征，染色結(jié)果都顯示：POX、SB染色為陰性，αNAE、PAS為強(qiáng)陽(yáng)性，ALP染色有1%為弱陽(yáng)性，這與文獻(xiàn)報(bào)道的MSCs的染色特點(diǎn)相一致[34]。進(jìn)一步證明了培養(yǎng)出的成纖維樣細(xì)胞為MSCs。圖1.4d羊水貼壁細(xì)胞圖2.7d羊水貼壁細(xì)胞圖3.10d羊水貼壁細(xì)胞圖4.10d臍血貼壁細(xì)胞圖5.羊水臍血MSCs生長(zhǎng)曲線

3討論

間質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，是細(xì)胞組織工程的首選種子細(xì)胞之一。然而人骨髓中的MSCs含量較少，大約104～105個(gè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞中只含有一個(gè)MSCs[5],這顯然難以滿足細(xì)胞組織工程的實(shí)際需要，因此尋找MSCs的來(lái)源和如何在體外分離擴(kuò)增MSCs就顯得較為重要。為了更好的得到MSCs，我們分別對(duì)孕婦的羊水和新生兒臍帶血進(jìn)行了MSCs的分離，并對(duì)所得的MSCs生物學(xué)特性進(jìn)行了比較，以期得到更好的MSCs來(lái)源。

間充質(zhì)干細(xì)胞的分離,我們主要參考了Friedenstein建立的MSC分離方法并做了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，利用MSCs的粘附性來(lái)獲得MSCs。本實(shí)驗(yàn)將羊水細(xì)胞和臍血單個(gè)核細(xì)胞接種于含10%胎牛血清PRMI1640培養(yǎng)基中，3d后去除未貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞單層長(zhǎng)滿80%后，用胰酶消化傳代，本法可去除一些貼壁的非間質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)幾次傳代后即可得到相對(duì)較純的MSCs。

本研究中采用孕婦的羊水和新生兒臍帶血標(biāo)本都可以成功地得到MSCs，這與國(guó)外報(bào)道的相一致[6]，可作為未來(lái)組織工程學(xué)的一個(gè)不可或缺的來(lái)源[7]。兩者在形態(tài)和生物學(xué)特性上都非常類似，但是臍血源性的MSCs形態(tài)呈短梭形。明顯不同的就是人羊水源性MSCs增殖能力明顯要優(yōu)于臍血源性MSCs,這一點(diǎn)可以從生長(zhǎng)曲線與傳代能力都得到較好體現(xiàn)。人羊水源性MSCs群體倍增時(shí)間較臍血源性MSCs倍增時(shí)間短，且人羊水源性MSCs的傳代能力明顯強(qiáng)于臍血源性MSCs。

綜上所述，與臍血源性間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力相比,羊水MSCs的獲得更為可觀，是組織工程種子細(xì)胞的又一可靠來(lái)源。

【參考文獻(xiàn)】

[1]馮建勛,臘曉林,馬艷,等.兩步法分離和培養(yǎng)人羊水來(lái)源胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞及其向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué),2009,21(12):729733.

[2]田少奇，王麗，孫康，等.人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其多向分化潛能的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)骨與關(guān)節(jié)損傷雜志，2009，24(2)：108111.

[3]ZiporiD.Mesenchymalstemcells:harnessingcellplasticitytotissueandorganrepair[J].BloodCellsMolDis,2004,33(3):211215.

[4]李現(xiàn)鐸，耿紅全，朱哲，等.羊水作為間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的可行性研究[J].中華小兒科雜志，2006，27(9)：449452.

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